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第一部分:痫性发作对神经元葡萄糖摄取及ZAG表达的影响目的:明确痫性发作对神经元葡萄糖摄取及ZAG表达的影响。方法:1.提取并培养新生24小时内SD乳鼠原代皮层神经元,并构建神经元无镁人工脑脊液痫性发作模型。2.Fluo-4,AM钙成像实验验证无镁造模后神经元的放电情况。3.台盼蓝染色实验检测无镁造模后神经元的细胞死亡率。4.2-NBDG荧光法和葡萄糖摄取比色检测试剂盒检测无镁造模后神经元的葡萄糖摄取情况。5.Western blot验证无镁痫性发作模型神经元中ZAG蛋白的表达情况。结果:1.Fluo-4,AM钙成像实验结果显示无镁痫性模型组神经元中无镁痫性模型组神经元中Fluo-4的平均荧光强度明显高于对照组（40.5730±7.4175 vs.23.2827±5.5209,p=0.036,n=3）。2.台盼蓝结果提示无镁造模后神经元的死亡率并无明显改变（0.2825±0.0140 vs.0.2985±0.0594,p=0.574,n=5）。3.2-NBDG法结果显示无镁痫性发作模型组神经元的葡萄糖摄取明显降低（28.3392±2.5323 vs.57.7486±11.9154,p=0.001,n=5）;葡萄糖比色检测试剂盒结果同样显示无镁痫性发作模型组神经元中2-DG6P水平显著下降（23.8385±0.3544pmol vs.65.0876±3.1367pmol,p=0.002,n=3）。4.无镁痫性发作模型组神经元中ZAG蛋白表达水平明显降低（0.5151±0.0229 vs.1,p<0.001,n=5）。结论:1.无镁人工脑脊液造模成功增加神经元中钙离子浓度,模拟神经元放电,但不影响神经元细胞死亡率。2.痫性发作抑制了神经元的葡萄糖摄取及ZAG蛋白的表达。第二部分:ZAG对神经元葡萄糖摄取及GLUT-3表达的影响目的:明确ZAG对神经元葡萄糖摄取以及神经元中GLUT-3表达及分布的作用。方法:1.提取并培养新生24小时内SD乳鼠原代皮层神经元。2.ZAG过表达病毒（LV-ZAG）、过表达空载体病毒（LV-ZAG Control）、ZAG敲低病毒（LV-RNAi）和敲低空载体病毒（LV-RNAi Control）分别干预原代皮层神经元。3.过表达ZAG后建造无镁人工脑脊液神经元痫性发作模型,具体分组为:LV-ZAG Control组、LV-ZAG Control+Seizure组和LV-ZAG+Seizure组。4.q RT-PCR检测慢病毒转染后神经元中ZAG的m RNA表达情况。5.Western blot方法检测慢病毒转染后各组神经元中ZAG蛋白表达水平,以及各组神经元中GLUT-3总表达水平以及在膜上的表达水平。6.葡萄糖比色法检测试剂盒检测各组神经元的葡萄糖摄取情况。结果:1.过表达ZAG慢病毒转染后神经元中ZAG的m RNA水平（170.0247±59.3013 vs.1,p=0.008,n=3）和蛋白表达水平（1.8524±0.4981vs.1,p=0.004,n=7）明显增加;敲低ZAG慢病毒转染后神经元中ZAG的m RNA水平（0.3710±0.0864 vs.1,p=0.006,n=3）和蛋白水平（0.4915±0.0952 vs.1,p<0.001,n=9）明显减少。2.葡萄糖比色检测试剂盒结果显示:敲低ZAG病毒转染神经元中2-DG6P水平明显降低（43.1083±1.2138pmol vs.66.6940±2.3152pmol,p<0.001,n=3）,LV-ZAG+Seizure组神经元中2-DG6P水平较LV-ZAG Control+Seizure组显著增加（74.7602±2.4926pmol vs.23.8852±2.3108pmol,p<0.001,n=3）。3.Western blot结果显示痫性发作时神经元中m GLUT-3表达（0.4722±0.0343 vs.1,p<0.001,n=7）、t GLUT-3表达（0.7227±0.0950 vs.1,p=0.001,n=7）和m GLUT-3/t GLUT-3比值（0.6602±0.0777 vs.1,p<0.001,n=7）明显减少,而过表达ZAG可以改善痫性发作对m GLUT-3（1.0968±0.1078 vs.0.4722±0.0343,p<0.001,n=7）、t GLUT-3（0.9514±0.0770 vs.0.7227±0.0950,p=0.001,n=7）和m GLUT-3/t GLUT-3（1.1640±0.1789 vs.0.6602±0.0777,p<0.001,n=7）的抑制作用。同样地,敲低ZAG神经元中m GLUT-3（0.5353±0.0338 vs.1,p<0.001,n=7）、t GLUT-3（0.6407±0.0514 vs.1,p<0.001,n=7）和m GLUT-3/t GLUT-3比值（0.8405±0.0889 vs.1,p=0.003,n=7）也明显降低。结论:ZAG可能通过增加神经元中GLUT-3的表达和GLUT-3向膜上的分布,从而增加神经元的葡萄糖摄取。第三部分:IGF1R对神经元葡萄糖摄取及GLUT-3表达的作用目的:探究IGF1R对神经元葡萄糖摄取及GLUT-3表达的作用。方法:1.提取并培养新生24小时内SD乳鼠原代皮层神经元。2.IGF1R的激动剂IGF1及IGF1R的特异性抑制剂AXL1717分别干预神经元,细胞分组如下:Control组、DMSO组、IGF1组和AXL1717组。3.IGF1干预神经元48小时后构建无镁神经元痫性发作模型,将细胞分为3组:DMSO组、DMSO+Seizure组和IGF1+Seizure组。4.采用Western blot方法检测各组神经元中总GLUT-3以及膜上GLUT-3的表达水平。5.葡萄糖摄取比色检测试剂盒定量检测各组神经元的葡萄糖摄取情况。结果:1.IGF1干预增加神经元中2-DG6P水平（71.6212±1.5726pmol vs.65.6981±0.8682pmol,p=0.027,n=3）,而AXL1717干预则降低了神经元中2-DG6P水平（42.7565±0.8686pmol vs.65.6981±0.8682pmol,p<0.001,n=3）。2.IGF1干预增加了神经元中的m GLUT-3（1.8310±0.1803 vs.1.0600±0.0957,p<0.001,n=5）和t GLUT-3（2.1675±0.1739 vs.0.9824±0.1045,p<0.001,n=5）蛋白表达水平,但是却降低了m GLUT-3/t GLUT-3比值（0.8512±0.1281 vs.1.0930±0.1777,p=0.032,n=5）。而AXL1717干预则抑制了神经元中m GLUT-3（0.6612±0.0590 vs.1.0712±0.1003,p=0.001,n=5）和t GLUT-3（0.5950±0.0983 vs.1.1173±0.1267,p<0.001,n=5）蛋白表达水平,对m GLUT-3/t GLUT-3比值没有影响（1.2332±0.2879 vs.0.9679±0.1357,p=0.275,n=5）。3.IGF1处理可以增加痫性发作神经元中的2-DG6P水平（76.5301±5.9879pmol vs.23.8385±0.3544pmol,p=0.004,n=3）。同时,IGF1处理还可以增加痫性发作神经元中m GLUT-3（1.2730±0.0509 vs.0.4408±0.1129,p<0.001,n=3）和t GLUT-3（1.5620±0.0783 vs.0.6599±0.0660,p<0.001,n=3）蛋白水平,但对痫性发组神经元中m GLUT-3/t GLUT-3比值（0.8174±0.0730 vs.0.6720±0.1890,p=0.536,n=3）却没有影响。结论:IGF1R通过增加神经元中GLUT-3的表达从而增加神经元的葡萄糖摄取,但是IGF1R对神经元中GLUT-3向膜上的分布没影响。第四部分:IGF1R在ZAG对神经元葡萄糖摄取及GLUT-3表达调控中的作用目的:探究IGF1R在ZAG对神经元葡萄糖摄取及GLUT-3表达的调控中作用。方法:1.提取并培养新生24小时内SD乳鼠原代皮层神经元。2.慢病毒及药物双重干预神经元,细胞分组:LV-RNAi Control+DMSO组、LV-RNAi+DMSO组、LV-RNAi+IGF1组、LV-ZAG Control+DMSO组、LV-ZAG+DMSO组和LV-ZAG+AXL1717组。3.Western blot方法检测各组神经元中膜上和总的GLUT-3蛋白表达情况,以明确IGF1R在ZAG对神经元GLUT-3表达及分布调节中的作用。4.葡萄糖摄取比色检测试剂盒定量检测慢病毒及药物干预后各组神经元的葡萄糖摄取情况,以明确IGF1R在ZAG对神经元葡萄糖摄取调节中的作用。结果:1.IGF1干预增加了敲低ZAG神经元中2-DG6P水平（74.3259±0.9644pmol vs.43.1083±1.2138pmol,p<0.001,n=3）,并且增加了敲低ZAG神经元中m GLUT-3（1.8712±0.2292 vs.0.4309±0.0282,p<0.001,n=5）和t GLUT-3（2.4296±0.3112 vs.0.5293±0.0890,p<0.001,n=5）蛋白表达水平,但对敲低ZAG神经元中m GLUT-3/t GLUT-3比值（0.8174±0.0730 vs.0.6720±0.1890,p=0.536,n=5）没有影响。2.AXL1717干预抑制了过表达ZAG神经元中2-DG6P水平（32.2651±2.7077pmol vs.73.6646±0.8720pmol,p<0.001,n=3）,并且抑制了过表达ZAG神经元中m GLUT-3（1.0551±0.1903 vs.2.6585±0.6528,p=0.010,n=3）和t GLUT-3（0.5385±0.0866 vs.1.4672±0.3638,p<0.001,n=3）蛋白表达水平,但对过表达ZAG神经元中m GLUT-3/t GLUT-3比值（1.9778±0.3422 vs.1.8962±0.6950,p=1.000,n=3）没有影响。结论:ZAG对神经元葡萄糖摄取和GLUT-3表达的调节是通过IGF1R实现的,但ZAG对神经元GLUT-3向膜上的分布调节作用不受IGF1R影响。第五部分:ZAG对IGF1R的作用目的:探讨原代皮层神经元中ZAG对IGF1R的作用。方法:1.提取并培养新生24小时内SD乳鼠原代皮层神经元。2.慢病毒分别转染原代皮层神经元:LV-ZAG Control组、LV-ZAG组、LV-RNAi Control组和LV-RNAi组。3.过表达ZAG病毒干预后再构建无镁人工脑脊液痫性发作模型,分组:LV-ZAG Control组、LV-ZAG Control+Seizure组和LV-ZAG+Seizure组。4.CO-IP验证ZAG与IGF1R间的相互作用。5.Western blot检测各组神经元中膜上的、总的以及磷酸化的IGF1R蛋白表达水平。结果:1.CO-IP结果显示ZAG与IGF1R间存在相互结合。2.敲低ZAG病毒干预组神经元中mIGF1R（0.5641±0.0786 vs.1,p<0.001,n=11）和p IGF1R（0.5583±0.0624 vs.1,p<0.001,n=11）蛋白表达降低,t IGF1R（1.0400±0.086 vs.1,p=0.155,n=11）蛋白水平没有明显变化。过表达ZAG病毒干预组神经元中mIGF1R（1.7917±0.2945 vs.1,p<0.001,n=7）和p IGF1R（2.4018±0.2190 vs.1,p<0.001,n=7）蛋白水平显著增加,但t IGF1R（1.0283±0.0675 vs.1,p=0.310,n=7）蛋白水平仍没有明显差异。3.痫性发作神经元中mIGF1R（0.5716±0.0269 vs.1,p<0.001,n=5）、p IGF1R（0.3069±0.0609 vs.1,p=0.010,n=5）和t IGF1R（0.5417±0.0205 vs.1,p<0.001,n=5）蛋白水平和p IGF1R/t IGF1R比值（0.5417±0.0205 vs.1,p<0.001,n=5）明显减少,而mIGF1R/t IGF1R比值（1.0346±0.2259 vs.1,p=1.000,n=5）却没有明显变化。过表达ZAG可以增加痫性发作神经元中的mIGF1R（1.5821±0.1657 vs.0.5716±0.0269,p<0.001,n=5）、p IGF1R（1.0311±0.5127 vs.0.3069±0.0609,p=0.007,n=5）蛋白水平,但是对痫性发作神经元中t IGF1R蛋白水平（0.6158±0.2235 vs.0.5668±0.1124,p=0.958,n=5）没有影响。结论:ZAG可能通过与IGF1R相互结合,从而增加了神经元中IGF1R在膜上的分布及其磷酸化水平;而在痫性发作时,ZAG表达减少从而抑制了IGF1R在膜上的分布及其磷酸化水平。