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研究背景神经炎症反应是神经退行性疾病及认知功能障碍的主要病理机制。神经退行性疾病导致的认知功能障碍,主要表现为学习和记忆能力受损,严重影响患者的生活质量,并增加家庭和社会负担。神经炎症反应的病理特征主要包括中枢神经系统(central nervous system,CNS)小胶质细胞激活,引起促炎因子和趋化因子释放增加导致炎症反应,以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放增加导致氧化应激,此外还有Aβ淀粉聚集、细胞凋亡等,最终导致神经元损伤。小胶质细胞是CNS中的主要免疫细胞,在固有免疫反应和组织损伤修复过程中发挥重要作用,小胶质细胞过度激活介导的神经毒性作用是神经炎症反应介导神经退行性疾病的重要病理机制。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为革兰氏阴性菌的一种内毒素,是小胶质细胞的强力激活剂。研究表明LPS通过与小胶质细胞表面Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)结合,上调核转录因子(nuclear transcription factor,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路及白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)相关激酶表达从而激活小胶质细胞,分泌大量促炎细胞因子、神经毒性分子、蛋白酶及ROS等。氧化应激,主要由ROS释放和氧化还原防御系统的破坏引起,也是神经炎症反应介导神经退行性疾病及认知功能障碍的另一重要病理机制。氧化应激与小胶质细胞激活密切相关,氧化爆发是小胶质细胞激活的早期生化事件,小胶质细胞激活后通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶,释放大量氧自由基和过氧化氢。细胞凋亡是一种维持细胞内环境稳定的自发程序性死亡过程,是多细胞生物维持内环境稳定的重要机制。研究表明神经炎症反应引起的神经元凋亡被认为是导致认知功能障碍的另一潜在机制。神经炎症损伤导致细胞凋亡,引起突触传递障碍,在认知功能障碍动物模型中发挥重要作用。甲烷是作为最简单的烷烃链有机物,同时也是重要的温室效应气体。由于气体本身的理化性质,甲烷可通过简单扩散方式自由穿过细胞膜进入细胞器。此外,甲烷还能自由透过体内生物屏障,如血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)等。近年来大量研究发现甲烷具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用,在缺血再灌注(ischemia reperfusion injury,IR)心肌损伤、脊髓损伤、以及胰腺炎、肝炎、急性肺损伤,甚至糖尿病视网膜病变等疾病中发挥保护作用。然而甲烷在神经炎症反应及认知功能障碍中是否也具有保护作用,还未见相关报道。本实验通过建立神经炎症损伤动物模型,从动物行为学和分子生物学方面探索LPS诱导小鼠神经炎症损伤及认知功能障碍的可能机制,进一步探究了甲烷的抗炎、抗氧化、抗凋亡特性在小鼠神经炎症损伤中的作用及其可能机制,并在离体环境下进行验证。研究方法1.甲烷改善小鼠神经炎症损伤导致认知功能障碍的研究8-12周雄性C57BL/6小鼠(20-25 g)随机分为:对照组,饱和甲烷盐水(methane-rich-saline,MS)组,LPS组和LPS+MS组,在完成5天的Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)定位导航训练后通过腹腔注射LPS(5 mg/kg)建立小鼠神经炎症损伤模型,0.5 h及此后每12 h,对照组及LPS组注射生理盐水20 m L/kg,MS组及LPS+MS组注射MS 20 m L/kg,连续注射7天,共计14次。24 h及第7天时通过旷场试验(open field test,OFT)评估小鼠的自发活动能力,第7天OFT完成2 h后进行MWM空间探索测试评估小鼠的空间记忆能力。2.甲烷通过抗炎作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究实验一:8-12周雄性C57BL/6小鼠(20-25 g)随机分为:对照组和LPS组,通过腹腔注射LPS(5 mg/kg)建立小鼠神经炎症损伤模型,收集前额皮质和海马组织(对照组8 h;LPS组2、4、6、8 h)通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测促炎因子表达。实验二:8-12周雄性C57BL/6小鼠(20-25 g)随机分为:对照组,MS组,LPS组和LPS+MS组,通过腹腔注射LPS(5 mg/kg)建立小鼠神经炎症损伤模型,0.5 h及此后12 h时,对照组及LPS组注射生理盐水20 m L/kg,MS组及LPS+MS组注射MS 20 m L/kg,共计2次。LPS腹腔注射4 h时收集前额皮质和海马组织通过ELISA检测促炎因子表达;LPS腹腔注射24 h及第7天时收集小鼠完整脑组织通过免疫荧光染色检测海马组织离子钙接头蛋白抗原-1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,IBa-1)表达;LPS腹腔注射24 h及第7天时收集海马组织通过免疫印迹试验检测P65-NF-κB及P38-MAPK表达及磷酸化水平。3.甲烷通过抗氧化作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究实验一:8-12周雄性C57BL/6小鼠(20-25 g)随机分为:对照组,MS组,LPS组和LPS+MS组。通过LPS(5 mg/kg)腹腔注射建立小鼠神经炎症损伤模型,0.5 h及此后12 h时,对照组及LPS组注射生理盐水20 m L/kg,MS组及LPS+MS组注射MS 20 m L/kg,共计2次。LPS腹腔注射24 h时收集海马组织和前额皮质检测丙二醛(malonaldehyde,MDA)表达及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。实验二:收集第二部分研究中石蜡包埋的完整脑组织切片样本通过免疫荧光染色检测海马组织8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHd G)表达。收集第二部分研究中蛋白变性的海马组织样本通过免疫印迹试验检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)和NADPH氧化酶-2(NOX-2)表达。4.甲烷通过抗凋亡作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究收集第二部分研究中石蜡包埋的完整脑组织切片样本通过原位末端转移酶标记技术(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)检测海马组织中细胞凋亡情况。收集第二部分研究中蛋白变性的海马组织样本通过免疫印迹试验检测Bax及Bcl-2表达。5.体外探索甲烷抗炎抗氧化抗凋亡作用的研究实验一:BV-2细胞铺板后分为对照组和LPS组,对照组加入等量无血清DMEM,LPS组加入LPS(100 ng/m L),两组各分为4个亚组,分别加入MS(0、5、10、20μL/m L),通过MTT试验检测BV-2细胞的细胞活力。实验二:BV-2细胞铺板后分为对照组、MS组、LPS组和LPS+MS组,等量生理盐水或MS(20μL/m L)预处理0.5 h后加入LPS(100 ng/m L)刺激BV-2细胞诱导炎症反应。6 h后收集上清培养基通过ELISA检测促炎因子表达。实验三:BV-2细胞铺板后分为对照组、MS组、LPS组和LPS+MS组,等量生理盐水或MS(20μL/m L)预处理0.5 h后加入LPS(100 ng/m L)刺激BV-2细胞诱导炎症反应。1 h后收集细胞样本通过免疫印迹试验检测P65-NF-κB及P38-MAPK表达及磷酸化水平、i NOS及NOX-2表达,以及Bax/Bcl-2表达水平。实验结果1.甲烷改善小鼠神经炎症损伤后认知功能障碍各组小鼠在MWM定位导航训练期间均能寻找到隐藏平台,平均逃避潜伏期和平均游泳距离逐渐缩短。组内比较,除LPS组外,其余三组每天平均速度无明显统计差异;组间比较各组小鼠每天平均潜伏期、平均游泳距离和平均速度均无明显统计差异。OFT结果显示甲烷干预能增加LPS诱导神经炎症损伤24 h时小鼠水平移动距离和活跃时间;而第7天时四组小鼠水平移动距离和活跃时间均无明显统计差异。各组小鼠在MWM空间探索测试期间游泳距离和速度均无明显统计差异,甲烷干预能增加小鼠跨越平台次数和目标象限移动距离百分比。2.甲烷通过抗炎作用减轻小鼠神经炎症损伤LPS诱导神经炎症损伤4 h时促炎因子表达均达峰值。甲烷能抑制LPS诱导神经炎症损伤4 h时促炎因子IL-6、TNF-α及IL-1β表达;还能减弱24 h及第7天时海马组织IBa-1标记的阳性信号强度及细胞体/细胞尺寸比例从而抑制小胶质细胞激活。此外甲烷干预通过抑制LPS诱导小鼠神经炎症24 h时P-38-MAPK及P-65-NF-κB磷酸化,以及第7天时P-38-MAPK的磷酸化,减轻炎症反应。3.甲烷通过抗氧化作用减轻小鼠神经炎症损伤甲烷能降低LPS诱导神经炎症损伤24 h时MDA表达,提高SOD活性;还能减弱海马组织8-OHd G标记的阳性信号强度;并通过抑制i NOS及NOX-2表达抑制LPS诱导神经炎症损伤急性期的氧化应激。4.甲烷通过抗凋亡作用减轻小鼠神经炎症损伤甲烷能减少LPS诱导小鼠神经炎症损伤24 h及第7天时TUNEL标记的细胞凋亡比率;并通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达及降低Bax/Bcl-2比率抑制细胞凋亡。5.甲烷通过抗炎抗氧化抗凋亡作用减轻LPS诱导BV-2炎症反应甲烷及LPS对BV-2细胞生长活力无明显影响。甲烷能抑制LPS刺激BV-2细胞炎症反应后促炎因子IL-6及TNF-α表达;并通过抑制P-38-MAPK及P-65-NF-κB磷酸化,i NOS及NOX-2蛋白表达,提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达及降低Bax/Bcl-2比率在离体环境下发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡作用。结论甲烷可改善LPS诱导小鼠神经炎症损伤后认知功能障碍。甲烷的保护作用可能与其抑制P65-NF-κB及P38-MAPK的磷酸化从而抑制小胶质细胞的激活和促炎因子释放有关,还与抑制i NOS及NOX-2表达从而减轻氧化应激以及抑制Bax/Bcl-2凋亡系统从而减轻细胞凋亡有关。本研究结果为后续临床进一步探索预防和治疗神经炎症反应导致的认知功能障碍及神经退行性疾病提供了理论依据。