新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是产荚膜担子菌,主要通过鸟的粪便,土壤腐生物等在自然界传播,经过呼吸道,感染有免疫缺陷的病人,如：艾滋病患者,器官移植后接受免疫抑制治疗的患者和接受大量固醇药物治疗的人群,并导致脑膜炎等中枢神经系统疾病,严重者危及生命。尽管如此,目前还没有治疗新型隐球酵母感染的特效药,并且患者需要终身用药。现在临床上多使用两性霉素B,氟氢可的松以及氟康唑,但这些药物的毒副作用非常明显,并且不断出现药物耐受反应,所以隐球酵母感染很难治愈。目前为止,普遍认为新型隐球酵母致病性主要与以下三个因素有关：37℃条件下能够生长的能力,合成多糖荚膜以及产生多酚氧化酶——漆酶。 根瘤农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性细菌,主要用于介导植物转化,同样此方法也适用于介导新型隐球酵母的转化。通过农杆菌和酵母细胞的接合作用, T-DNA随机插入整合到酵母基因组中。农杆菌介导的新型隐球酵母转化较电转化,基因枪转化有其自身优点：1.转化效率高,转化材料简单易得；2.转化子稳定；3.转化子中单拷贝插入现象普遍,易于进行基因分析。漆酶是新型隐球酵母的主要致病因子,它为含铜多酚氧化酶,能够氧化儿茶酚等合适的底物生成黑色素,高葡萄糖浓度抑制漆酶的表达。本实验旨在通过农杆菌介导新型隐球酵母转化的方法,以及漆酶可以氧化多酚底物(去甲肾上腺素,NE)生成黑色素这一表型,在抑制漆酶表达的培养基上(4％Asn,加入NE至终浓度为0.1 mg/ml)筛选漆酶去葡萄糖阻遏突变株,从而进一步克隆得到突变基因。本实验通过此方法,得到一株去葡萄糖阻遏表达漆酶的突变株(T-DNA单拷贝插入),并通过反向PCR成功获得该突变基因。该基因编码柠檬酸合成酶(Citrate Synthase,CS),记为CIT1。相应的突变菌株被命名为Δcit,回补菌株为Δcit::CIT。 三羧酸循环(TCA)是酵母细胞产生能量的重要代谢途径,其主要功能是产生能源分子ATP和细胞物质代谢的众多分子前体,对于维持酵母生存及其他生命活动至关重要。柠檬酸合成酶则是该反应中的限速酶,催化乙酰-CoA和草酰乙酸反应合成柠檬酸,是三羧酸循环的重要调节点,直接影响三羧酸循环的进行。本实验对该柠檬酸合成酶突变株(Δcit)的生长表型进行了检测：发现其在多种碳源培养基上生长缓慢,形成与野生型相比较小的菌落；发现该突变菌株细胞容易聚集；其对抗高温,高碱等压力条件的能力也明显减弱。在致病因子方面：多糖荚膜变小；在大于2％浓度的葡萄糖培养基漆酶去阻遏,产生黑色素；通过尾静脉注射小鼠检测菌株致病能力,发现其无毒力。对回补菌株(Δcit::CIT)进行相同实验,相应表型及其致病能力全部恢复到与野生型菌株相同程度。值得强调的是,该突变株致病因子发生改变等表征将新型隐球酵母致病性与细胞三羧酸循环联系了起来,说明三羧酸循环是致病真菌必须的生理保证,同时也为抗真菌药物研究提供了新靶点。