【摘 要】
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水稻、小麦和玉米等禾谷类作物在成熟收获前如碰到持续高温多雨的天气往往会出现穗上发芽的现象,常将这种现象称为穗萌。我国地域辽阔,水稻种植和生产面积广泛,由于穗萌现象常导致萌发后的种子失去食用价值、种用价值和贮藏价值,通常作为饲料等利用,造成巨大的经济损失。本研究首先验证了大麦糊粉层特异启动子Amy32b在水稻中的表达情况,同时将Amy32b启动子TATA-box周围锚定上Tet O操纵序列进行修饰改
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水稻、小麦和玉米等禾谷类作物在成熟收获前如碰到持续高温多雨的天气往往会出现穗上发芽的现象,常将这种现象称为穗萌。我国地域辽阔,水稻种植和生产面积广泛,由于穗萌现象常导致萌发后的种子失去食用价值、种用价值和贮藏价值,通常作为饲料等利用,造成巨大的经济损失。本研究首先验证了大麦糊粉层特异启动子Amy32b在水稻中的表达情况,同时将Amy32b启动子TATA-box周围锚定上Tet O操纵序列进行修饰改造为Amy32m启动子,分析Amy32m启动子在水稻中的表达情况;其次以Tet-on调控系统为基础,Os Amy1A为目标基因构建一个水稻抗穗萌诱导调控系统载体p3F,并将Amy32b启动子和Amy32m启动子应用在水稻抗穗萌诱导调控系统载体p3F上;验证p3F载体的抗穗萌诱导调控功能,结果表明可在一定程度上减缓种子萌发速率。主要研究结果如下:(1)将大麦Amy32b基因起始密码子ATG前688bp作为Amy32b启动子区域,与红色荧光报告基因RFP连接转入到水稻中,通过观察转基因株系中红色荧光表达情况发现Amy32b启动子在水稻种子糊粉层特异表达。构建以Amy32b启动子驱动红色荧光报告RFP的p C1BR载体,将该载体通过农杆菌介导法转入到水稻品种明恢86中,观察转基因株系与对照组的种子横切、纵切时红色荧光的表达情况,与对照组相比,转基因株系中种子糊粉层处可观察到明显红色荧光,结果表明大麦Amy32b基因起始密码子ATG前688bp序列具有启动子活性,并且在水稻种子的糊粉层处特异表达。(2)在Amy32b启动子TATA-box附近锚定上Tet O序列改造成Amy32m启动子,与红色荧光报告基因RFP连接转入水稻品种明恢86中,观察Amy32m启动子在水稻中的表达情况,研究发现Amy32m启动子在水稻种子糊粉层处特异表达。构建以Amy32m启动子驱动红色荧光报告基因RFP的p C2MR载体,将该载体通过农杆菌介导法转入到水稻品种明恢86中,观察转基因株系与对照组的种子横切、纵切时红色荧光的表达情况,与对照组相比转基因株系中种子糊粉层处明显可观察到红色荧光,结果表明Amy32m启动子的功能与Amy32b启动子一致,并未因修饰改造发生任何改变。(3)以Tet-on调控系统为基础,Os Amy1A为目标基因构建了一个水稻抗穗萌诱导调控系统载体p3F,将该载体通过农杆菌介导法转入水稻中,研究发现p3F转基因种子的萌发速率在一定程度下减缓了。构建以Amy32b启动子驱动r Tet R蛋白的调节表达盒5TM,以Amy32m启动子驱动的Os Amy1A反义RNA的应答表达盒3MS。将调控表达盒5TM与应答表达盒3MS反向连接构建于同一载体上p LJ02上并命名为p3F,在诱导剂Dox存在时,由Amy32b启动子驱动的r Tet R蛋白可与Amy32m中的Tet O操纵序列特异结合,阻遏Amy32m启动子的表达从而抑制Amy32m驱动的Os Amy1A基因反义RNA表达盒表达,使种子可正常萌发;在没有诱导剂Dox存在时,Os Amy1A基因反义RNA表达盒正常表达,使Os Amy1A的表达受到抑制从而抑制种子的正常萌发。通过验证水稻抗穗萌诱导调控系统载体p3F转基因种子分别经过Dox和dd H2O处理下的萌发情况,结果表明,经dd H2O处理下种子的萌发速率与经Dox处理下种子的萌发速率相比在一定程度上减缓了,在水稻生产和杂交稻制种时,减缓种子的萌发速率也可一定程度上降低因穗萌现象造成的产量损失和经济损失,可为后续调控水稻穗萌的研究提供参考。
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