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本研究旨在建立高效表达目的蛋白的原核表达载体系统pESP15b/pARA-SP6。在Novagen公司专利产品pET11a的基础上进行改造组建,即用SP6启动子替代T7启动子,并引入组氨酸标签(His tag)从而构建表达载体pESP15b。又以质粒pBlueScript(SK+)和pGro7为基础,构建另一个表达载体pARA-SP6。从而建立原核表达载体系统pESP15b/pARA-SP6。 为了使pESP15b/pARA-SP6表达载体能够最大限度地表达目的蛋白,以碱性磷酸酶(ShAP)为目的蛋白,对载体的宿主和培养温度进行了探讨。为了考察pESP15b/pARA-SP6表达系统的蛋白表达效果,以传统的原核表达载体pET28(a)System和最新上市的原核表达载体CSP System(pColdI载体)作为对照,以碱性磷酸酶(ShAP)为目的基因,对目的蛋白的表达量、可溶性目的蛋白的含量和蛋白活性等方面进行了比较。 通过SDS-PAGE、Western blotting、pNPP活性测定以及ImageMaser 1D Elite V3.01软件等分析结果表明,所构建的原核蛋白表达载体pESP15b/pARA-SP6,在蛋白酶缺陷型大肠杆菌BL21宿主中目的蛋白的表达量最高;在37℃、30℃和25℃条件下分别诱导表达,目的蛋白的表达量随温度的降低而明显增加,37℃培养条件下目的蛋白ShAP占蛋白表达总量的21.2%,而25℃时则达到32.5%;25℃培养条件下可溶性目的蛋白占蛋白总量的65.2%,为37℃时的2倍左右;目的蛋白的活性也随培养温度的降低而明显提高,37℃培养条件下为48.3U/g菌体,而25℃时为1117.6U/g菌体,活性提高约25倍。 作为对照的pET28(a)和pColdI蛋白表达体系,在最佳表达条件下,虽然目的蛋白的表达量与pESP15b/pARA-SP6表达体系无很大差异(分别为28.8%和32.85%),但可溶性目的蛋白含量只占蛋白表达总量的30%左右,明显低于pESP15b/pARA-SP6蛋白表达系统。蛋白活性也明显低于新构建的pESP15b/pARA-SP6表达体系,分别为247.8U/g菌体和452U/g菌体,只是pESP15b/pARA-SP6载体系统的1/5和1/2。