邻苯二甲酸酯(Phthalates,PAEs)是一类典型的环境内分泌干扰物,被广泛用作塑料产品生产中的增塑剂。PAEs可以通过多种途径进入机体,对机体的多组织器官产生毒性作用。随着全球儿童和青少年肥胖率的逐年增加,PAEs与肥胖之间的关系逐渐引起了人们的关注。研究发现,PAEs暴露可以影响机体的脂质代谢,促进脂肪细胞分化和脂质沉积,与肥胖的发生密切相关。本研究对青春期学生尿液中PAEs代谢产物的水平进行检测,分析探讨青春期学生尿液PAEs代谢产物水平与脂质代谢的关系;并通过动物实验明确每日估计摄入量最高的PAEs—DEHP暴露对青春期大鼠脂质代谢的影响;再结合本课题组前期研究,分析探讨JAK-STAT-PPARγ信号通路在PAEs暴露与血浆脂质水平关联中的中介作用。本研究可为青春期肥胖及脂质代谢紊乱相关疾病的防治提供科学依据。第一部分青春期学生尿液中PAEs代谢产物的水平及其与生活行为方式的关联性研究目的:评估青春期学生PAEs的暴露情况,探讨生活行为方式与尿液中PAEs代谢产物水平间的关联性。方法:采用整群随机抽样的方法,经知情同意后,选择吉林省某高校16~19岁的大一新生为研究对象,共463例。通过问卷调查收集研究对象的一般人口学资料和生活行为方式资料。采集研究对象的血液和尿液。采用肌氨酸氧化酶法检测研究对象尿肌酐水平。采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测研究对象尿液中的7种PAEs代谢产物(包括DEHP代谢产物MEHP、MEOHP、MEHHP、MECPP和MCMHP,DEP代谢产物MEP,DBP的代谢产物MBP)。采用IBM SPSS24.0软件进行数据处理和分析,采用药代动力学公式计算DEHP、DEP和DBP的每日估计摄入量,并评估PAEs的暴露风险;采用独立样本t检验、Mann-Whitney检验和多元线性回归模型分析PAEs代谢产物水平与生活行为方式间的关联。检验水准为α=0.05。结果:1.除了MEOHP和MEHHP的检出率分别为99.4%和98.7%外,其余5种PAEs代谢产物的检出率均为100%。2.研究对象尿液中MBP的中位数浓度最高,为42.80μg/L,其次是∑DEHPm(34.56μg/L)和MEP(27.50μg/L),DEHP代谢产物的中位数浓度由高到低依次为MECPP(13.00μg/L)、MCMHP(7.58μg/L)、MEOHP(6.04μg/L)、MEHHP(4.78μg/L)和MEHP(3.18μg/L),且肌酐调整后的趋势相同。3.每日估计摄入量中位数最高的PAEs(2.41μg/kg·bw/d)是DEHP,其次是DBP(2.18μg/kg·bw/d)和DEP(1.35μg/kg·bw/d)。基于肌酐模型计算的DEHP,DBP和DEP的每日估计摄入量中位数分别为1.50、1.33和0.82μg/kg·bw/d,低于体积模型。4.在463名研究对象中,有12名(2.6%)研究对象的DBP的每日估计摄入量超过了10μg/kg·bw/d(TDI参考限值),且有13名(2.8%)显示具有PAEs暴露所致抗雄激素的累积风险。在肌酐模型中,3名(0.6%)研究对象的DBP的每日估计摄入量超过了10μg/kg·bw/d,有5名(1.1%)显示具有抗雄激素的累积风险。5.使用塑料食品包装材料与尿液MEHP、MEHHP、MECPP和∑DEHPm水平呈显著正相关(P<0.05),体育锻炼时长与MEOHP水平呈显著负相关(P<0.05),经常食用快餐与MBP水平呈显著正相关(P<0.05),护理类和美容/修饰类化妆品使用频率与MEP水平呈显著正相关(P<0.05)。结论:1.青春期学生普遍暴露于DEP、DBP和DEHP。2.青春期学生每日估计摄入量最高的PAEs是DEHP。3.约有3%的青春期学生有抗雄激素作用的累积风险。4.青春期学生尿液中PAEs代谢产物的水平受生活行为方式的影响。第二部分青春期学生尿液中PAEs代谢产物水平与脂质代谢的关联研究目的:明确青春期学生尿液中PAEs代谢产物的水平与脂质代谢的关联性,探讨其潜在机制。方法:以463名青春期学生为研究对象,测量研究对象的身高、体重、腰围和臀围,计算BMI和WHR;使用全自动生化分析仪检测研究对象血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平;采用Real-time PCR法测量研究对象外周血白细胞中脂质代谢相关基因SREBP-2、SR-BI、LDLR、NR1H3和ABCA1 mRNA的表达水平。采用多元线性回归模型分析青春期学生尿液中PAEs代谢产物水平与体格测量指标、血浆脂质水平以及外周血白细胞中脂质代谢相关基因mRNA水平的关联性。检验水准设为α=0.05。结果:1.研究对象的WHR与尿液中MECPP和∑DEHP水平呈显著正相关关系(P<0.05)。2.研究对象尿液中MBP、MECPP、MCMHP和∑DEHP与HDL-C呈显著正相关(P<0.05);除MCMHP外,所有DEHP代谢产物均与TC/HDL-C呈显著正相关(P<0.05);所有DEHP代谢产物均与LDL-C/HDL-C呈显著正相关(P<0.05)。3.研究对象外周血白细胞SREBP-2、NR1H3、LDLR mRNA表达水平与尿液中MCMHP水平呈显著正相关(P<0.05),SR-BI mRNA表达水平与MECPP和MCMHP水平呈显著正相关(P<0.05)。结论:1.PAEs暴露可能促进青春期肥胖的发生。2.PAEs暴露可能干扰青春期学生血浆中脂质的水平。3.PAEs暴露可能会干扰脂质代谢相关基因SREBP-2、NR1H3、SR-BI和LDLR mRNA的表达,影响脂质代谢。第三部分DEHP暴露对青春期大鼠脂质代谢的影响目的:明确每日估计摄入量最高的PAEs—DEHP暴露对青春期大鼠脂质代谢的影响,探讨DEHP影响青春期大鼠脂质代谢的作用机制。方法:选取健康清洁级Wistar大鼠80只,21日龄,雌雄各半,适应性饲养后采用第一部分中青春期学生每日摄入量最高的PAEs—DEHP对大鼠进行灌胃染毒。共分为4个剂量组,对照组(玉米油)、低剂量DEHP染毒组(5 mg/kg/d)、中剂量DEHP染毒组(50 mg/kg/d)和高剂量DEHP染毒组(500 mg/kg/d),每日清晨灌胃染毒一次,连续染毒8周。染毒结束后,麻醉处死大鼠,收集血液和肝脏组织。使用全自动生化分析仪和生化试剂盒检测大鼠血清和肝脏中TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平;采用Real-time PCR法检测大鼠肝脏中脂质代谢相关基因SREBP-2、CYP7A1、SR-BI、LDLR、NR1H3和ABCA1的mRNA表达水平;采用Western-Blot法测定肝脏中脂质代谢相关蛋白SREBP-2、CYP7A1、SR-BI、LDLR、NR1H3和ABCA1的表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析,采用单因素方差分析比较多组间差异,采用LSD法进行组间两两比较。检验水准为α=0.05。结果:1.高剂量DEHP染毒组大鼠血清TC水平显著高于对照组和低剂量DEHP染毒组(P<0.05),HDL-C水平显著高于其他各组(P<0.05),LDL-C水平显著高于对照组(P<0.05)。2.高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏组织TC水平显著高于其他各组(P<0.05);中、高剂量DEHP染毒组HDL-C水平显著高于对照组和低剂量DEHP染毒组(P<0.05)。3.中、高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏SREBP-2 mRNA表达水平显著高于对照组和低剂量DEHP染毒组(P<0.05);各剂量DEHP染毒组大鼠肝脏CYP7A1和LDLR mRNA表达水平均显著低于对照组(P<0.05);各剂量DEHP染毒组大鼠肝脏SR-BI mRNA水平均显著低于对照组(P<0.05),且高剂量DEHP染毒组显著低于中剂量DEHP染毒组(P<0.05);低、高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏NRIH3和ABCA1的mRNA水平均显著低于对照组(P<0.05),且ABCA1 mRNA水平显著低于中剂量DEHP染毒组(P<0.05)。4.中、高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏SREBP-2蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05);高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏CYP7A1和NR1H3蛋白水平显著低于其他各组(P<0.05),且中剂量DEHP染毒组显著低于对照组(P<0.05);高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏SR-BI蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05);高剂量DEHP染毒组大鼠肝脏ABCA1蛋白表达水平显著低于低剂量DEHP染毒组(P<0.05)。结论:1.DEHP暴露可以干扰青春期大鼠血清和肝脏的脂质水平。2.DEHP暴露能够改变青春期大鼠肝脏脂质代谢相关基因SREBP-2、CYP7A1、SR-BI、LDLR、NR1H3和ABCA1 mRNA和蛋白的表达。3.DEHP暴露可以影响青春期大鼠体内胆固醇和脂蛋白的代谢,干扰胆固醇的逆向转运过程,影响脂质代谢。第四部分JAK-STAT-PPARγ信号通路对PAEs暴露与青春期学生血浆脂质水平关联的中介作用目的:明确PAEs暴露对青春期学生外周血细胞中JAK-STAT-PPARγ信号通路相关基因的影响,探讨JAK-STAT-PPARγ信号通路在PAEs暴露与青春期学生血浆脂质水平关联中的中介作用。方法:以青春期学生为研究对象,采用Real-time PCR法检测研究对象外周血白细胞中JAK-STAT-PPARγ信号通路相关基因的mRNA表达水平;采用多元线性回归模型分析研究对象尿液中PAEs代谢产物水平与JAK-STAT-PPARγ信号通路相关基因mRNA相对表达水平的关联;采用中介模型分析JAK-STAT-PPARγ信号通路对PAEs暴露与青春期学生血浆脂质水平关联的中介作用,检验水准设为α=0.05。结果:1.研究对象尿液中DEHP代谢产物的水平与JAK2 mRNA表达水平存在显著的正相关关系(P<0.05);DEHP代谢产物和MBP与JAK3基因的mRNA表达量呈显著正相关(P<0.05);MEOHP和MEHHP与STAT5b的表达水平呈显著正相关(P<0.05);MEOHP和MCMHP与PPARγ的表达水平间存在显著的正相关关系(P<0.05)。2.研究对象外周血白细胞JAK3 mRNA表达水平在MEHP、MEOHP、MEHHP、MECPP和∑DEHP与TC/HDL-C的关联中存在中介作用,中介比例范围为15.71%~17.18%,JAK3 mRNA表达水平在DEHP代谢产物与LDL-C/HDL-C关联中的也具有中介作用,且中介比例范围为12.69%~20.86%;STAT5b mRNA表达水平在MEOHP、MEHHP和∑DEHP与TC/HDL-C的关联中存在中介作用,中介比例范围为6.59%~10.76%;PPARγmRNA表达水平在MEOHP与TC/HDL-C的关联中具有中介作用,中介比例为14.87%,且PPARγ基因在MEOHP和MCMHP与LDL-C/HDL-C的关联中也存在中介作用,中介比例分别为15.06%和18.12%。结论:1.PAEs暴露可上调青春期学生外周血细胞中JAK2、JAK3、STAT5b和PPARγ基因的mRNA表达。2.JAK3、STAT5b和PPARγ基因的mRNA的表达水平在PAEs代谢产物水平与TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C的关联中存在中介作用。3.PAEs可能是通过JAK-STAT-PPARγ途径来干扰青春期学生血浆脂质水平,影响脂质代谢。