芒果胶孢炭疽病菌应答菌丝机械损伤产生无性孢子的分子机制

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芒果采后炭疽病由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Penz.&Sacc.)引起。在实验室内用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),28℃培养胶孢炭疽菌,产生很少或基本不产生孢子,但胶孢炭疽菌菌丝在机械损伤后24-48 h会有大量分生孢子产生,且该菌应答机械损伤诱导产孢的核心基因及关键代谢通路尚未有报道。本研究基于转录组测序(RNA-Seq)技术测定了芒果胶孢炭疽菌菌丝在机械损伤处理后2 h内5个时间点的基因表达变化,通过差异基因筛选、聚类分析、对差异基因及聚类内的功能富集分析、调控网络构建,初步分析了胶孢炭疽菌胁迫下的基因表达模式,筛选可能参与应答机械损伤胁迫,诱导产孢的“核心基因”。从转录组数据中随机选取5个基因,通过荧光定量PCR技术,探究各基因m RNA翻译和转录的相关性。结合转录组分析结果中差异基因的富集结果和网络结构拓扑图,选择转录本ELA23432(在网络结构图中编号为55),即候选基因Cg14957。对Cg14957进行了克隆和分析,通过同源重组原理构建了基因敲除和互补载体并转化原生质体,筛选获得了敲除和互补转化子菌株,初步研究了其生物学功能。结果表明:(1)各样本转录组数据分布均匀,测序质量可靠,相关性较强;对损伤处理下不同的时间序列的样本表达数据进行分析,得到差异基因417个;(2)差异基因富集在127个GO富集分类中,具有显著性富集的GO富集有21个,主要涉及跨膜转运蛋白活性、氧化还原过程等生物学过程;KEGG富集分析主要集中在4个代谢途径;(3)差异基因表达模式分析获得12个聚类模块,处理后1 h内聚类2、4、5、7、8、9、10、11主要表现为瞬时响应应激,主要参与了氧化还原过程等;聚类3、6、12持续响应损伤应激,具有跨膜转运、氧化还原等相似的功能;(4)再构建了基因间的调控网络,结合富集分析结果最终筛选出12个胶孢炭疽菌响应损伤胁迫的“核心基因”;(5)Cg14957基因是由1263个碱基组成,编码一个含420个氨基酸的蛋白,该蛋白不含任何已知信号肽,含7个跨膜结构;(6)构建了Cg14957的敲除和互补载体并转化原生质体,最终筛选获得(35)Cg14957敲除和Res-(35)Cg14957互补突变体菌株;(7)对突变体菌株的生物学特征分析表明:基因Cg14957可能与胶孢炭疽菌菌落生长有关,调控胶孢炭疽菌分生孢子产量和形态;对胶孢炭疽菌的致病性有较大影响。
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