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研究背景:癫痫(epilepsy)是一种常见的神经系统疾病,频发的癫痫发作可导致脑部严重的损害、意外伤害及精神创伤等,给患者、家庭和社会带来沉重的负担。目前我国的癫痫的患病率约7.2‰,存在900余万的癫痫患者,虽经正规的抗癫痫药物治疗,仍有近1/3患者的癫痫发作难以得到有效的控制,发展为难治性癫痫,其中颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy,TLE)是最常见的难治性癫痫。氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型是Honchar于1983年首次报道,该模型与人类颞叶癫痫模型在神经电生理、神经元损伤、行为学表现等方面相似,是目前研究颞叶癫痫和癫痫持续状态常用的动物模型之一。A型肉毒毒素(Botulinum neurotoxin A,BoNT/A)是一种由厌氧梭状芽孢杆菌产生的神经毒素蛋白,可特异性酶切突触囊泡转运相关蛋白,进而抑制突触前膜神经递质释放,抑制Na~+通道,降低神经元兴奋性,为抗癫痫作用提供了理论依据。近来研究表明颅内海马区注射肉毒毒素(Botulinum neurotoxin,BoNT)可抑制急性期癫痫发作,减轻海马神经元损伤,减少慢性期癫痫发作频率,进一步证实了BoNT可作为一种潜在的抗癫痫药物。然而,既往的研究均采用颅内注射给药方式,存在创伤性、操作复杂、易感染、不利于长期给药等弊端,且未进一步探讨BoNT的作用机制。相较于颅内注射,鼻腔给药是一种方便、无创性的给药方式,并可绕过血脑屏障,快速进入中枢神经系统,满足了慢性疾病需长期给药的需求。目前对BoNT/A抑制癫痫发作的具体机制、能否通过鼻腔给药减少癫痫持续状态诱发的神经元损伤,还有待进一步研究。研究目的:本课题通过观察氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元形态学及自噬、凋亡相关蛋白Beclin-1、Bax,Caspase-3及Bcl-2表达水平的改变,探讨癫痫诱发神经元损伤的机制;探究鼻腔滴注BoNT/A给药方式的可行性,观察其对致痫大鼠行为学、神经元损伤的影响,并检测凋亡自噬、凋亡相关蛋白表达水平,探讨BoNT/A神经保护作用的潜在机制。材料与方法:120只健康雄性SD大鼠,6-7周,220g-250g,随机分为CON组(正常大鼠)、PILO组(致痫大鼠)、PILO+NS组(致痫大鼠+鼻腔滴注生理盐水)和PILO+BoNT/A组(致痫大鼠+鼻腔滴注BoNT/A),PILO组包括3h、8h、24h、72h亚组。PILO+NS、PILO+BoNT/A组大鼠腹腔麻醉后取仰卧位,给予鼻腔滴注等量生理盐水或BoNT/A预处理,CON、PILO组同期仅给予腹腔麻醉处理,并记录各组大鼠体重变化。给药后第50天,四组大鼠给予腹腔注射氯化锂(3mEq/kg),20小时后,CON组腹腔注射生理盐水,余腹腔注射匹鲁卡品(30mg/kg)。大鼠癫痫发作持续60min后,腹腔注射水合氯醛(0.3mg/kg)终止发作。根据Racine痫性发作等级标准,Ⅳ或V级发作判定为造模成功,记录各组造模成功率及潜伏期。造模成功后PILO组3h、8h、24h亚组于癫痫发作终止后各时间点断头取脑,分离海马,采用Western blot法检测相应蛋白浓度,72h亚组于发作终止72小时后麻醉、灌注取脑,制作石蜡切片,采用尼氏染色检测海马神经元损伤。PILO+NS组、PILO+BoNT/A组于癫痫终止后24小时取海马,采用Western blot法检测相应蛋白浓度,剩余大鼠在SE后72小时麻醉后灌注取脑,制备石蜡及冰冻切片,观察神经元损伤、检测cleaved-SNAP-25。结果:1.行为学观察CON组大鼠行为正常,PILO组、PILO+NS组、PILO+BoNT组大鼠均出现癫痫发作,3组大鼠造模成功率及潜伏时间无统计学差异(p>0.05)。2.神经元形态学改变与CON组相比,PILO、PILO+NS组神经元出现明显损伤,数目减小,存在统计学差异(p<0.05),而PILO+BoNT/A组神经元数目较CON组减少,但无统计学差异(p>0.05);与PILO、PILO+NS组相比,PILO+BoNT/A组神经元数目增加,存在统计学差异(p<0.05)。3.Cleaved-SNAP-25分子检测PILO组大鼠嗅球、海马神经元内未检测到cleaved-SNAP-25,而PILO+BoNT/A组嗅球、海马神经元胞体内可检测cleaved-SNAP-25。4.凋亡自噬相关蛋白表达与CON组相比,PILO组海马组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,诱导凋亡蛋白Bax、Beclin-1及Caspase-3蛋白水平升高,24小时内具有明显的变化趋势,具有统计学差异(p<0.05);相较于PILO组,PILO+BoNT/A组可抑制癫痫发作对相关蛋白的影响,具有统计学差异(p<0.05),PILO+NS组相关蛋白的变化无统计学差异(p>0.05)。结论:1.氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型造模操作简便,成功率高,大鼠癫痫行为学表现明显。2.癫痫持续状态引起海马神经元损伤,以CA1、CA3区为著,涉及神经元自噬、凋亡途径。3.BoNT/A可经鼻给药进入大鼠中枢神经系统(嗅球、海马区),证实了该给药途径的可行性。4.BoNT/A对氯化锂-匹鲁卡品诱发的癫痫持续状态导致的神经元损伤具有保护作用,可能参与神经元自噬、凋亡途径。5.鼻腔给药可为BoNT/A在抗癫痫领域提供新的给药途径。