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实验背景及研究目的 冠心病是人类死亡的最常见病因之一,冠心病最基本的病理生理过程是心肌缺血,挽救缺血心肌的根本性措施是迅速而有效的恢复缺血心肌的血流灌注。但是近年来研究者们发现部分患者局部心肌缺血后恢复正常的灌注,其缺血区的损伤反而更加严重,这表明再灌注会引起新的损伤。这种在缺血的基础上由于再灌注所引起的再次损伤称为缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。随着研究的不断深入,人们发现心肌微血管的损伤很可能在心肌I/R损伤中发挥着重要作用。其一,缺血再灌注造成的冠状动脉内皮和微血管功能失调是无复流现象发生的主要机制。其二,在缺血再灌注早期,心肌微血管内皮细胞(cardiacmicrovascularendothelialcells,CMECs)的凋亡早于心肌细胞,并且受损的心肌微血管可以通过释放炎性介质,促发心肌细胞凋亡。因此,在I/R损伤过程中,心肌微血管的损伤很可能是心肌损伤的起始因素,保护缺血再灌时的CMECs能减轻心肌I/R损伤。 在心肌缺血再灌注损伤的机制中,线粒体的结构与功能改变扮演着重要角色。有文献报道,在缺血再灌注的心肌中,线粒体的分裂明显增加,而抑制线粒体的分裂,可以保护缺血再灌注时的心肌细胞。然而对于CMECs的I/R损伤,线粒体的分裂扮演着什么样的角色,抑制线粒体的分裂又是否对CMECs的缺血再灌损伤有着同样的保护作用,其机制是什么,至今仍无文献报导。 本实验采用体外培养大鼠CMECs,模拟缺血再灌注(SI/R)损伤。初步探讨线粒体分裂在大鼠心肌微血管内皮细胞缺血再灌注损伤中的作用及机制,为临床解决心肌缺血再灌注损伤提供新的思路和靶点。 实验方法 实验一:建立CMECs的I/R损伤模型的并探讨I/R损伤对线粒体分裂的影响 1.分离培养大鼠CMECs,模拟缺血再灌注(I/R)模型,随机将细胞分为对照组和SI/R组;2.采用MTT法检测细胞活性;3.Transwell法检测细胞迁移能力;4.AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术及TUNEL法检测CMECs凋亡率;5.荧光显微镜观察各组CMECs线粒体形态;6.westernblot法检测各组细胞Drp1,Fis1水平;7.活性氧检测试剂盒测CMECs胞浆ROS水平;8.线粒体超氧化物标记物Mitosox检测细胞线粒体ROS水平;9.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞线粒体膜电位。 实验二:抑制线粒体分裂对I/R损伤CMECs的保护作用及机制研究 1.分离培养大鼠CMECs,建立SI/R模型,随机将细胞分为对照组、SI/R组、SI/R+Mdivi-1(一种线粒体分裂抑制剂)组以及SI/R+NAC(一种活性氧清除剂)组;2.采用MTT法检测细胞活性;3.Transwell法验检测细胞迁移能力;4.AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术及TUNEL法检测CMECs凋亡率;5.荧光显微镜观察各组CMECs线粒体形态;6.westernblot法检测各组细胞Drp1,Fis1水平;7.活性氧检测试剂盒测CMECs胞浆ROS水平;8.线粒体超氧化物标记物Mitosox检测细胞线粒体ROS水平;9.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞线粒体膜电位。 统计学分析: 采用SPSS11.0统计软件包对组间差异行差分析,多组间的比较采用单因素方差分析(OneWayANOVA),若总体差异显著,再以t检验进行组间比较。数据结果以X±S表示,P<0.05为差异有统计学意义。 实验结果 1.与对照组比较,SI/R组CMECs活性和迁移能力明显降低,凋亡增多,细胞Drp1,Fis1蛋白水平明显升高,线粒体分裂增加,呈片断状或点状。胞浆ROS水平和线粒体ROS水平明显增高,线粒体膜电位降低。 2与SI/R组相比,SI/R+Mdivi-1组细胞活性和迁移能力明显增高,凋亡减少,线粒体分裂受到抑制,呈管网状,但是细胞Drp1,Fis1蛋白水平并无明显变化,细胞胞浆ROS水平和线粒体ROS水平明显降低,线粒体膜电位升高。 3.与SI/R组相比,SI/R+NAC组胞浆ROS水平和线粒体ROS水平明显降低,线粒体分裂受到抑制。 实验结论 1.I/R损伤引起CMECs活性降低,迁移能力减弱、凋亡增加,并使细胞线粒体分裂增加,线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1表达上调,细胞胞浆ROS水平及线粒体ROS水平增加,线粒体膜电位降低。 2.用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1抑制线粒体分裂后,可以减少I/R损伤导致的CMECs损伤,降低细胞内ROS水平及线粒体体ROS水平,升高线粒体膜电位。 3.抗氧化剂NAC可以减少I/R损伤引起的细胞胞浆ROS水平及线粒体ROS水平增高,并抑制线粒体的分裂。 综上所述,I/R损伤引起的细胞线粒体分裂增加很可能是I/R损伤心肌微血管内皮的机制之一。抑制细胞线粒体分裂可以通过降低ROS水平,稳定线粒体膜电位来保护I/R时的心肌微血管内皮细胞。而I/R损伤时ROS的生成与线粒体的分裂很可能有着相互促进的作用。