第一部分:分子探针的构建、表征及鉴定背景:应用近红外吸收材料作为外源性光声探针材料已经被广泛应用,因为它可以提高PAI敏感性和较深的组织穿透能力。我们设计由两性PDI大分子自组装形成纳米颗粒,cRGD肽再在纳米颗粒表面修饰而构建新的分子探针cRGD-PDINPs,成功靶向血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa受体,成功“点燃”了活体小鼠早期静脉血栓。实验第一部分的目的即为了评估所制备的分子探针cRGD-PDI NPs的设计、表征及鉴定。方法:用于形成纳米颗粒的苝酰亚胺类分子的合成是通过四步化学反应获得。先将二溴苝四酸酐和长的燕尾烷基胺反应,获得对称性的结构。此步骤利用长烷基链改善了花四酸酐的油溶性,使得其更加利于后续修饰;紧接着对苝的港湾位置的二个溴原子分别进行吡咯烷的替换,利用氮原子的供电子作用,使得苝酰亚胺能够拥有近红外吸收。脱去一头燕尾烷基链,为了能够做成不对称的分子结构;进一步,聚乙二醇的引入,为该不对称分子提供了水溶性和生物相容性;纳米粒子通过超声作用,在水溶液中形成纳米颗粒,并且通过化学键和上多肽分子cRGD和cRAD。形成的纳米粒子,最外层是具有靶向功能性的多肽分子,以及具有生物相容性的PEG分子,纳米粒子核心为具有近红外吸收的茈酰亚胺分子。对构建的分子探针分别进行各种表征:在四氢呋喃中测试紫外吸收图谱,在PBS中测试水溶性、稳定性,在牛血清中测试血液稳定性,在活体内PAI测定半衰期,激光照射测试其光稳定性。MTT法评估cRGD-PDINPs的细胞毒性。结果:每一个分子结构都采用了氢谱分析、碳谱分析和MALDI-TOF质谱分析得到证实。苝酰亚胺分子在四氢呋喃中的紫外吸收图谱显示其近红外吸收峰值为700nm处。合成的PDI纳米颗粒呈墨绿色,水溶性表现良好,溶解度可以达到10mg/mL,获得的cRGD-PDI和cRAD-PDI纳米探针在TEM下观察直径稳定分别是40.0 ± 3.1 nm和41.2 士2.5 nm,在PBS液中用DLS测量则直径分别是70.3 ± 2.3 nm和68.9 ± 3.2 nm。MALDI-TOF MS分析未结合cRGD或者cRAD的PEG与结合cRGD或者cRAD的PEG的比例大约为2:1。cRGD-PDI光声纳米探针在水溶液的最大吸收波长形成俩个峰值分别是650nm和700nm,吸收系数为2.58x108 M-1cm-1。cRGD-PDI纳米探针溶液暴露在700nm波长的激光照射下(8mJcm-2)分别照射0,10,20,和30分钟,在紫外-可见光-近红外光下的吸收光谱图,可见探针材料几乎没有任何吸收减弱。PAI活体内检测纳米探针的半衰期大约为22小时。MTT法评估cRGD-PDI NPs的细胞毒性显示在cRGD-PDINPs的浓度从0-100 μg/mL时细胞的成活率均保持在90%以上。结论:我们构建的分子探针cRGD-PDI NPs具备光、水、血液中良好的稳定性及血液中足够长的循环时间并且价格低、易修饰,生物相容性好、细胞毒性低,在前期实验中也证实其具备较深的成像深度。在接下来的实验中也体现出体外、体内良好的靶向性。所有这些优点预示其具备极高的临床转化应用前景。第二部分:有机分子探针增强PAI体内特异性期靶向早期静脉血栓形成及监测溶栓的实验研究目的:制备静脉血栓形成特异性分子探针,通过目测及PAI定量分析评价其体内外与靶点结合能力,同时活体内监测早期血栓的溶栓效果。方法:在体外实验中,运用新鲜含有枸橼酸盐的血液,通过离心法从全血中获得富含血小板血浆,然后加入ADP(20μmol/mL)和凝血酶受体激活肽(30μmol/L)激活血小板,将构建的分子探针与激活的血小板共培育后反复洗涤接受PA光谱分析。在体内实验中,应用5%FeC13诱导建立小鼠颈部静脉非完全阻塞性静脉血栓形成模型,然后分别行US、MRI、PAI成像,评价各种成像模态的不同,再经尾静脉注射分子探针后PAI,评价其体内特异性靶向能力。最后在分子探针辅助下PAI进行实施动态监测溶栓效果。在每一阶段实验结束后获取动物相关标本进行病理学检查。结果:体外靶向能力显示,分子探针cRGD-PDINPs靶向体外特异性靶向激活血小板组血小板肉眼可观察到均匀绿色血小板沉淀物,在PBS、cRAD-PDINPs组处理过的血小板没有任何颜色,进一步行PA光谱分析显示cRGD-PDI组血小板沉淀物的PA信号强度峰值在700nm处,与cRGD-PDI NPs在水溶液中的PA信号强度最高峰值及光谱波形图相似。应用5%FeCl3诱导成功建立稳定小鼠颈部静脉非完全阻塞性静脉血栓形成模型。US成像正常颈部静脉管腔呈均匀黑色状或者黑灰状,而附壁血栓在管壁上呈模糊的白灰色凸起。MRI可以提供详细的相关解剖信息及较US高的分辨率,但是无法提供清晰的血栓成像信息。PAI可以提供良好的血管成像,血栓部位呈一个明显的PA信号缺失。经尾静脉注射分子探针cRGD-PDINPs活体内PAI中可见其成功地“点燃”静脉血栓形成,作为对照,经尾静脉注射cRAD-PDINPs和PBS的小鼠,其血栓区中未发现增强的PA信号。在陈旧性血栓模型中经尾静脉注射分子探针cRGD-PDINPs后48小时期间血栓部位没有观察到增强的PA信号。分子探针cRGD-PDI NPs辅助PAI对早期静脉血栓的溶栓治疗治疗效果进行实时监测实验中,首先经尾静脉注射cRGD-PDI NPs,直到注射后6小时后观察到血栓区域中增强的PA信号。然后再通过尾静脉注射50 000个国际单位IU的人用尿激酶用于溶栓治疗。在NPs注射后6小时,PAI可见“点亮”血栓周围的血管壁呈轻度不规则的缩窄边缘,这种状况仅在注射溶栓剂30分钟后血管壁边缘开始逐渐变得平滑,并且在药物注射后1小时变得与正常血管一样变得平滑。溶栓药物注射48小时后与未溶栓治疗的早期血栓PA信号不同,溶栓治疗后的PA信号减弱几乎与正常血管相同。早期静脉血栓形成模型制作后切取相应段静脉血管行病理学检查提示非阻塞性静脉血栓形成模型制作成功。免疫组织化学的相应结果表明,GPⅡb/Ⅲa蛋白在实验组静脉管腔内的血栓中大量表达,在阻塞组中的血栓中表达较少,但是在对照颈静脉血栓中就更少。对主要器官7 dNPs注射后的病理检查H&E染色进行初步评估了分子探针cRGD-PDI NPs在小鼠体内的毒性反应。其中PDINPs主要积聚的脏器如肝,脾和肾进行脏器病理检查H&E染色,病理检查结果提示脏器在细胞结构上没有表现出明显的损伤。此外,也没有发现有明显的炎症细胞聚集。结论:上述结果表明,构建的有机分子探针高效、精准靶向激活血小板表面活GPⅡb/Ⅲa受体蛋白,在活体内PAI成功有效“点燃”早期静脉血栓形成。并且所构建的分子探针cRGD-PDINPs具有独特的性质:具有高PA信号强度,高生物相容性和光稳定性,以及对激活血小板表面膜蛋白GPⅡb/Ⅲa受体的高亲和力,从而可以更好地区分早期静脉血栓与陈旧性血栓。此外,基于PDINPs为基础构建的分子探针可以提供良好的PA信号,可以清晰剖析血栓的边缘管壁信息,并可因此来监测溶栓治疗。构建的分子探针具备良好的生物相容性和低细胞毒性极具临床转化前景。