肥胖症是一种常见的代谢疾病,随着人们生活水平的不断提高,肥胖症患者的人数在全球范围内逐年上升,引起世界各地医疗机构的广泛关注。当人体内摄入过多的卡路里时,多余的热量就会转变为脂质,储存于体内的脂肪组织中,当人体脂肪积累量远远超过正常生理所需时,脂肪细胞和组织的体积不断增大,最终演变成肥胖症。我们通常所说的脂肪堆积主要发生在体内的脂肪组织中,脂肪细胞是脂肪组织最主要的成分,而富含脂质的成熟脂肪细胞是通过前脂细胞(脂肪间充质干细胞)分化而来,同时伴随着细胞内脂质的不断沉积,脂肪细胞的细胞质被大量的脂质(脂滴)所占据,细胞浆的空间及细胞器的数量被压缩或减少,大量的脂质使脂肪细胞体积不断增大。细胞内脂肪的生成包括脂肪分化和脂质积累,在这个过程中有多种因子参与其中,并发挥一定的调控作用,例如PPARy和C/EBPs等。孤核受体NR4A1也被称为Nur77、TR3或NGFI-B等,在体内多种组织中都有广泛的表达,它能够接受多种刺激或信号,从而被诱导表达,并且能够以多种方式参与调控细胞功能,包括细胞增殖、凋亡、分化、免疫和代谢等生命活动。据报道,NR4A1作为转录因子,也参与调控葡萄糖和脂质的代谢。因此,本课题的主要目的是探究NR4A1在脂肪生成中的调控作用及其具体机制。我们发现:NR4A1能够直接结合GATA结合蛋白2(GATA2)的启动子,从而激活GATA2的转录表达,GATA2再作为转录因子抑制PPARγ的转录表达,最终抑制脂肪分化的过程;同时,NR4A1能够通过间接上调p53的表达来抑制固醇调控元件结合转录因子1(SREBP1)及其下游基因脂肪酸合成酶(FAS)的表达,通过抑制脂肪生成途径控制体重。通过研究NR4A1在脂肪生成中的调控机制,可为预防和治疗肥胖症提供新的可能。第一部分:在体实验观察NR4A1对肥胖形成的影响研究目的:鉴定野生鼠与敲除鼠的基因型和NR4A1的基因表达情况,研究NR4A1对小鼠体重和肥胖体征的影响。研究方法:1.剪取小鼠尾巴,通过传统方法抽提NR4A1敲除鼠及野生鼠的基因组DNA,采用Jackson实验室提供的鉴定引物对小鼠基因组DNA进行PCR鉴定,验证小鼠的基因型。2.提取小鼠附睾脂肪组织中的RNA,利用实时荧光定量PCR分析小鼠脂肪组织中NR4A1的mRNA表达量,验证敲除鼠的脂肪组织已经在mRNA水平上敲除了NR4A1的表达。3.提取小鼠附睾脂肪组织中的蛋白质,利用Western blot检测小鼠脂肪组织中NR4A1翻译表达的蛋白质含量,验证敲除鼠的脂肪组织已经在蛋白质水平上敲除了NR4A1的表达。4.使用含脂量为60%的高脂饲料喂养NR4A1敲除鼠及野生鼠14周,每周测量小鼠体重,比较两种小鼠之间的体重变化差异,并检测出小鼠脂肪组织的体积和质量,推算出两种小鼠的体脂率。5.提取小鼠的附睾脂肪组织,利用冰冻切片和HE染色技术,对比两种小鼠的附睾脂肪组织中脂肪细胞面积的大小。6.采用腹腔注射葡萄糖(GTT)或胰岛素(ITT)耐受试验检测两种小鼠体内的血糖变化,分析两种小鼠对葡萄糖或胰岛素耐受情况的差异。7.使用实时荧光定量PCR分析小鼠附睾脂肪组织中与脂肪分解和脂肪生成相关基因的mRNA表达水平。8.通过Western blot检测小鼠附睾脂肪组织中与脂肪分解和脂肪生成相关基因的蛋白质表达水平。研究结果:1.小鼠基因组PCR结果表明,电泳图谱中只包括一条DNA片段大小为180bp条带的小鼠是野生型小鼠,只包含一条DNA片段大小为350bp条带的小鼠是敲除型小鼠,包含两条DNA片段大小为180bp和350bp条带的小鼠是杂合型小鼠。2.以野生型小鼠为对照,NR4A1敲除型小鼠的附睾脂肪组织中NR4A1的mRNA含量明显降低。3.以野生型小鼠为对照,NR4A1敲除型小鼠的附睾脂肪组织中NR4A1的蛋白质含量明显降低。4.在高脂饲料喂养小鼠的14周中,NR4A1敲除型小鼠的体重增长得更快更多。14周后,NR4A1敲除型小鼠体内的脂肪组织与野生型小鼠相比总体积更大,并且NR4A1敲除型小鼠的体脂率更高。5.HE染色小鼠脂肪组织切片的结果显示,以野生型小鼠为对照,NR4A1敲除型小鼠附睾脂肪组织中的脂肪细胞面积更大。6.GTT结果显示,注射葡萄糖之后,与野生型小鼠相比,NR4A1敲除型小鼠的血糖升高的更快,并且更难恢复到正常的血糖水平。ITT结果显示,体内注射胰岛素之后,两种小鼠体内的血糖变化没有明显差异。7.通过检测对小鼠附睾脂肪组织内相关基因的mRNA表达量,我们发现两种小鼠脂肪组织内与脂肪分解相关基因中的HSL、ATGL、LPL和脂肪生成相关基因中的C/EBPβ和adiponectin表达量并没有明显差异,而另外两种脂肪生成相关基因PPARγ和FAS的表达量在敲除型小鼠中得到升高。8.通过检测小鼠附睾脂肪组织内相关基因的蛋白质表达量,我们发现两种小鼠脂肪组织内脂肪酸结合蛋白FABP4的蛋白表达量没有明显差异,而另外两种脂肪生成相关基因PPARγ和FAS的表达量在敲除型小鼠中得到升高。结论:以野生鼠为对照,NR4A1敲除鼠在高脂饲料喂养的条件下体重增长得更快更多,体内脂肪体积、体脂率、脂肪细胞面积等肥胖指标都具有明显升高。另外,NR4A1并不是通过脂肪分解的途径来影响肥胖,它可能是通过降低PPARγ和FAS的表达来调控脂肪细胞的分化与脂质积累。第二部分:NR4A1影响脂肪细胞分化和脂质积累的机制研究研究目的:探究孤核受体NR4A1对前脂细胞3T3-L1的脂肪分化和脂质积累过程中的作用及其调控机制。研究方法:1.培养前脂细胞3T3-L1,通过脂肪分化的诱导剂刺激细胞,诱导其分化为成熟脂肪细胞,并通过Western blot检测脂肪分化过程中NR4A1和PPARy、FAS的蛋白表达变化趋势。2.将过表达NR4A1的慢病毒及其对照病毒感染3T3-L1,再通过嘌呤霉素的药物筛选,得到能够稳定过量表达NR4A1的细胞株(OV细胞)及其对照细胞株(NC细胞),通过慢病毒带有的GFP绿色荧光反映病毒感染细胞的效率以及利用Western blot和实时荧光定量PCR检测细胞株中NR4A1的过表达效率。3.用诱导剂诱导两种前脂细胞(NC和OV细胞)进行脂肪分化,在脂肪分化过程中的第0天(DO)、第4天(D4)和第8天(D8)对细胞进行油红O染色,用来鉴定脂肪细胞的分化程度,并且比较NC和OV细胞分化程度的差异。4.提取脂肪分化过程中D0、D2、D4、D6和D8的细胞中的蛋白质,利用Western blot检测PPARy和FAS在脂肪分化过程中的蛋白表达变化,并对比NC和OV细胞之间的表达差异。5.双荧光素酶报告基因实验检测转录因子NR4A1分别对PPARγ和FAS,以及PPARy的转录抑制因子GATA2启动子转录表达的激活作用。6.利用ChIP-qPCR鉴定转录因子NR4A1与PPARγ、FAS启动子上的潜在结合位点,以及GATA2启动子上的两个潜在结合位点是否具有物理结合。7.利用Western blot对野生鼠和NR4A1敲除鼠的附睾脂肪组织中GATA2的蛋白表达差异进行检测,同时利用实时荧光定量PCR对野生鼠和NR4A1敲除鼠的附睾脂肪组织中GATA2的mRNA表达差异进行检测。8.利用表达靶向GATA2小干扰RNA的慢病毒去感染3T3-L1,经药物筛选得到敲低GATA2表达的稳转细胞株(KD细胞),再用过表达NR4A1的慢病毒去感染KD细胞,使其过量表达NR4A1,得到稳转细胞株(KD-OV细胞),将其诱导分化,提取D4细胞中的蛋白质和RNA,通过Western blot与实时荧光定量PCR分析NC、KD和KD-OV细胞中PPARγ的表达差异。9.通过实时荧光定量PCR分析NC和OV细胞脂肪分化过程中GATA2在mRNA水平上的表达差异。10.用Western blot分析NC和OV细胞脂肪分化过程中SREBP1c在蛋白水平上的表达差异。通过Western blot以及实时荧光定量PCR分析野生鼠和NR4A1敲除鼠附睾脂肪组织中p53的蛋白和mRNA表达差异。研究结果:1.在3T3-L1细胞的脂肪分化过程中,NR4A1的蛋白表达与PPARy和FAS的蛋白表达具有相似的变化趋势。2.用携带NR4A1表达片段的慢病毒去感染3T3-L1,病毒感染后的细胞群通过嘌呤霉素的药物筛选,得到能够稳定过量表达NR4A1的细胞株(OV细胞)。经验证,与NC细胞相比,OV细胞中含有较高mRNA和蛋白表达的NR4A1。3.油红O染色细胞脂肪分化过程,结果显示NC和OV细胞的脂肪分化都能被诱导成功,但OV细胞的脂肪分化受到了抑制。4.在前脂细胞的脂肪分化过程中,与NC细胞相比,OV细胞中PPARy和FAS的蛋白质表达量都有所降低。5.双荧光素酶实验结果表明,转录因子NR4A1对PPARy启动子的激活具有抑制作用,但是NR4A1对FAS启动子的转录激活并没有作用。另外,NR4A1对GATA2的启动子具有转录激活的作用。6.ChIP-qPCR结果显示,转录因子NR4A1与PPARy和FAS的启动子都没有物理性结合。但是与GATA2启动子上-1125bp到-1120bp的潜在结合位点(GATA2-1)有物理结合,但与GATA2启动子上-936bp到-931bp的潜在结合位点(GATA2-2)没有物理结合。7.通过对小鼠的体内验证,NR4A1敲除鼠的附睾脂肪组织中GATA2的蛋白和mRNA表达量都是降低的。8.与NC细胞相比,OV细胞中PPARγ蛋白质和mRNA的表达量降低,KD细胞中PPARy的蛋白质和mRNA表达量升高,但是在KD-OV细胞中,PPARy的表达量与NC细胞相似,敲低GATA2后NR4A1失去了对PPARy转录表达的抑制作用。9.在前脂细胞的脂肪分化过程中,GATA2的mRNA表达量呈现逐渐降低的趋势,但是在OV细胞中GATA2的mRNA表达量始终高于NC细胞。10.在前脂细胞的脂肪分化过程中,FAS的上游调控基因SREBP1c的蛋白表达量在OV细胞中是降低的。在敲除鼠的附睾脂肪组织中,p53在蛋白质和mRNA水平上的表达都是降低的。结论:转录因子NR4A1通过直接结合GATA2的启动子使其激活,从而抑制PPARy的转录表达。另外,NR4A1通过间接的方式激活p53的表达,从而抑制SREBP1c和FAS的表达。NR4A1通过这两条途径抑制前脂细胞的脂肪分化与脂质积累。