棉花是我国重要的经济作物,近年来,多种棉花病害严重制约我国的棉花生产。棉花枯萎病被认为是造成棉花产量和品质下降最严重的因素之一。MAPK级联信号通路是真核生物中高度保守的信号通路,在识别放大外部信号,并将信号传递到细胞内部过程中发挥重要的作用。大量的研究证实,MAPK级联信号通路的激活是植物免疫反应最早发生的事件之一,调控了多种植物抗毒素的生物合成和防卫相关基因的表达。因此,深入研究MAPK级联信号通路调控植物免疫反应的分子机制,对于指导农作物抗病育种具有重要的理论意义。然而,关于植物MAPK级联信号通路的研究多在拟南芥等模式植物中进行,针对其他植物,特别是棉花等农作物中MAPK级联信号通路的功能研究还比较少,MAPK级联信号通路的调控机制更是鲜有报道。本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)为实验材料,通过生物化学、分子生物学、生物信息学等多种手段,明确了GhMKK6介导的MAPK级联信号通路在调控棉花枯萎病抗性方面的重要作用,并探讨了miRNA和MAPK支架蛋白对GhMKK6介导的MAPK级联信号通路的调控机制。主要研究结果如下:(1)GhMKK6介导的MAPK级联信号通路在调控棉花对枯萎病菌的抗性方面发挥重要作用,但过量激活GhMKK6会对植物自身造成伤害。GhMKK6是棉花A组MEKs基因,亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核中。表达模式分析发现,枯萎病菌、SA和MeJA均能影响GhMKK6的表达水平,说明GhMKK6参与调控了棉花的免疫反应。利用病毒介导的基因沉默技术在棉花中沉默GhMKK6后发现,棉花对枯萎病菌的抗性显著下降,SA介导的植物抗病信号通路相关基因的表达水平显著低于对照棉花。利用农杆菌介导的叶盘转化法得到了GhMKK6超表达的转基因烟草。在GhMKK6超表达转基因烟草接种枯萎病菌后,尽管SA/JA介导的植物抗病信号通路相关基因的表达水平显著高于对照烟草,但转基因烟草仍表现出对枯萎病菌敏感的表型。利用点突变的方法,得到了组成型激活的GhMKK6和无活性的GhMKK6。在烟草叶片中瞬时表达不同活性的GhMKK6后发现,尽管烟草叶片都出现萎黄的症状,但瞬时表达组成型激活的GhMKK6可以通过促进下游抗性基因的表达,ROS的产生,SA/JA介导的植物抗病信号通路等提高植物对枯萎病菌的抗性。然而,GhMKK6的过量激活会导致活性氧的大量积累,产生类病斑,进而影响植物正常的生长发育。(2)ghr-miR5272a与GhMKK6组成了一个反馈调节系统,ghr-miR5272a通过反馈调节的方式,调控GhMKK6的表达水平,防止GhMKK6过量激活。对棉花miRNA深度测序结果分析后发现,ghr-miR5272a与GhMKK6的3′非编码区同源性较高。进一步的实验证明,GhMKK6是ghr-miR5272a的靶基因,ghr-miR5272a通过识别GhMKK6的3′非编码区,剪切GhMKK6的mRNA,调控GhMKK6的表达水平。表达模式分析发现,SA不能诱导ghr-miR5272a的表达,而MeJA和枯萎病菌都能诱导ghr-miR5272a的表达,ghr-miR5272a的表达模式与GhMKK6的表达模式互补,说明ghr-miR5272a可能通过影响GhMKK6的表达水平参与调控棉花对枯萎病菌的防卫反应。在棉花中沉默ghr-miR5272a后发现,GhMKK6对枯萎病菌的响应受到了显著抑制,SA/JA介导的植物抗病信号通路相关基因的表达水平显著高于对照棉花,且表达模式与GhMKK6超表达转基因烟草接种枯萎病菌后的表达模式相似。而在超表达miR5272的棉花中,GhMKK6的转录水平和蛋白水平均显著降低。超表达miR5272的棉花对枯萎病菌的抗性显著低于对照棉花,SA/JA介导的植物抗病信号通路相关基因的表达模式与GhMKK6沉默棉花接种枯萎病菌后的表达模式相似。(3)利用酵母双杂交技术筛选出GhMKK6的互作蛋白。利用棉花总RNA构建了棉花酵母双杂交文库,文库库容为1.4×10~6,插入片段平均长度约为1000bp。利用GhMKK6的开放阅读框全长序列构建了诱饵载体。自激活活性及毒性检测实验表明,该诱饵载体无自激活活性和毒性。利用诱饵载体通过酵母双杂交技术进行GhMKK6互作蛋白的筛选。在去除重复基因、不能翻译片段和测序失败片段后,共得到10个有意义的基因片段。通过序列分析及基因功能预测发现,筛选得到的10个GhMKK6互作蛋白主要与基因的转录和翻译,信号通路的转导,碳水化合物的代谢以及氧化还原过程有关。(4)GhMORG1是酵母双杂交筛库得到的GhMKK6互作蛋白之一。GhMORG1作为MAPK级联信号通路的支架蛋白,通过调控GhMKK6介导的MAPK级联信号通路影响棉花对枯萎病菌的抗性。GhMORG1的开放阅读框全长序列为900bp,编码一个由299个氨基酸残基组成的多肽。序列分析及蛋白质结构预测发现,该基因含有7个串联的WD40结构域,并形成环状的β-螺旋结构,可作为MAPK的支架蛋白调控MAPK级联信号通路。亚细胞定位分析表明,该基因与GhMKK6一样都定位于细胞核中。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现,GhMORG1与GhMKK6在细胞核中发生相互作用。表达模式分析表明,GhMORG1的表达受到枯萎病菌和MeJA的诱导,说明GhMORG1也参与调控了棉花的免疫反应。利用病毒介导的基因沉默技术得到了GhMORG1沉默的棉花植株。接菌实验表明,GhMORG1沉默的棉花对枯萎病菌的抗性显著下降,SA/JA介导的植物抗病信号通路相关基因的表达水平显著低于对照棉花。进一步的实验发现,超表达GhMORG1的转基因烟草对枯萎病菌的抗性显著升高,且SA/JA介导的植物抗病信号通路相关基因的表达模式与GhMKK6超表达转基因烟草接种枯萎病菌后的表达模式相似。