红芪和黄芪的免疫调节作用及抗免疫老化机制比较研究

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第一部分红芪属于豆科植物岩黄芪属,为多序岩黄芪的根,与黄芪同科不同属,两者均具有益气、补血等功效。在中医临床上常以红芪代用黄芪,但随着对红芪的不断研究,逐渐发现红芪与黄芪并不是同一味药,两者不仅在外观上有区别,在成分组成及含量等方面也有明显区别,从1985年版的中国药典开始就将红芪与黄芪分开,单列为一味中药。前期研究发现红芪与黄芪水提物或红芪多糖与黄芪多糖等在免疫调节作用上存在一定差异。而复方是中医防治疾病的主要临床应用形式,关于在复方水平对红芪与黄芪的免疫调节作用的比较研究未见报道,所以我们选择了以黄芪作为君药,纳入2010年中华人民共和国药典的经典扶正固表、补益方剂——玉屏风、复芪止汗、补中益气和益气养血方剂作为研究对象,以相同剂量的红芪替换黄芪,比较各复方用红芪与用黄芪对免疫抑制小鼠的免疫调节作用的差异,弥补红芪药理研究和药用理论的不足,解决黄芪药源的不足,为全面开发红芪的药用价值和推广应用提供理论支撑。首先通过注射环磷酰胺(CY)制备免疫抑制模型,实验结果显示CY组小鼠,反映固有免疫和适应性免疫的各种常用指标均有所下降,说明免疫抑制小鼠的模型制备成功。然后注射CY的同时给予含红芪或黄芪的玉屏风、复芪止汗、补中益气或益气养血水提物14日,检测指标结果如下:①含红芪和含黄芪的各组均可显著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏指数、腹腔巨噬细胞体外吞噬中性红的能力、血清IL-1β含量、NK细胞杀伤活性;其中含红芪的玉屏风、补中益气和益气养血组提高脾脏指数的作用较相应含黄芪复方组的作用强。②含红芪和含黄芪的各组均能提高CY所抑制的溶血素水平、CD19+B淋巴细胞百分比和血清IL-4含量。③含红芪和含黄芪的各组均能不同程度的提高免疫抑制小鼠T淋巴细胞的增殖反应、CD3+总T淋巴细胞和CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群百分比、血清IL-4和IFN-y的含量;其中含红芪的玉屏风和益气养血组在提高T淋巴细胞增殖能力、CD3+T淋巴细胞百分比、血清IFN-y含量的作用较相应含黄芪复方组的作用略高。故得出结论:①复方中用红芪与用黄芪在免疫调节方面具有相似的作用。②玉屏风、补中益气和益气养血复方中用红芪提高免疫抑制小鼠的细胞免疫作用稍优于黄芪。第二部分近年来,随着生活水平的提高和人们对疾病认识的深入,人类的平均寿命明显延长,而人口的老龄化伴随着严重的社会和医学问题,抗衰老迫在眉睫。在衰老机制中,免疫老化是加速衰老的重要原因,其中T淋巴细胞与衰老的关系己构成免疫老化学说研究的核心内容,通过调节细胞免疫可延缓衰老。实验一结果表明以红芪或黄芪为君药的相同复方免疫调节作用存在差异,含红芪玉屏风方剂对T淋巴细胞的调节作用更明显,故进一步选择玉屏风为研究复方,通过体外实验观察含红芪的玉屏风方剂与含黄芪的玉屏风方剂对自然衰老小鼠的T淋巴细胞的影响,探讨其抗免疫老化作用及其机制。首先制备含红芪和含黄芪玉屏风含药血清,利用脾淋巴细胞增殖试验确定最佳含药血清稀释浓度为40%,后续试验就用40%含药血清与脾淋巴细胞共培养观察相应指标。结果如下:①含红芪和含黄芪玉屏风含药血清可以提高自然衰老小鼠脾淋巴细胞的自身增殖和ConA诱导的增殖能力、CD3+CD28+T淋巴细胞亚群百分比和培养上清IL-2含量;降低CD3+CD28-T淋巴细胞亚群百分比。②通过透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、Hoechst33258荧光染色和流式细胞术检测各组脾淋巴细胞凋亡率,结果显示,老龄小鼠脾淋巴细胞的凋亡增加,给予含黄芪和含红芪的含药血清后可改善脾淋巴细胞的凋亡。利用Fluo-3AM荧光探针染色检测细胞内钙离子浓度,老龄小鼠脾淋巴细胞内钙离子升高,给于各组含药血清后钙离子变化不明显。进一步通过免疫细胞化学法观察小鼠脾细胞Fas、FasL、Bax和Bcl-2的表达、利用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位和分光光度法检测Caspase3酶活性以反映死亡受体介导的凋亡途径和线粒体凋亡途径。结果表明老龄小鼠脾淋巴细胞Fas、FasL和Bax表达增多,Bcl-2表达减少;线粒体膜电位下降、Caspase3的酶活性增高;同时加入含黄芪和含红芪玉屏风含药血清后脾淋巴细胞Fas、FasL和Bax表达减少,Bcl-2表达增多;线粒体膜电位升高、Caspase3的酶活性降低;且含红芪组增高线粒体膜电位的作用略优于含黄芪组。③利用蛋白质组学分析技术比较老龄小鼠脾淋巴细胞与含红芪或含黄芪的玉屏风含药血清体外作用干预后的老龄小鼠脾淋巴细胞总蛋白图谱的差异,寻找差异蛋白。结果可见各组之间老龄小鼠脾淋巴细胞多种蛋白质的表达发生变化,应用PDQuest8.0软件在各组间共选取了14个差异明显的蛋白质点进行质谱分析,共有9个蛋白得到成功鉴定,其中在玉红含药血清干预组中有5个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调;玉黄含药血清组3个蛋白表达上调,6个蛋白表达下调。结论:①老龄小鼠脾T淋巴细胞作用减弱。②含红芪和含黄芪玉屏风含药血清均可以通过调节T淋巴细胞作用延缓衰老。③老龄小鼠脾淋巴细胞体外培养后凋亡的发生率增加。④含红芪与含黄芪玉屏风含药血清均可以改善老龄小鼠脾淋巴细胞体外培养后的凋亡发生。且含红芪玉屏风含药血清在调节老龄小鼠脾淋巴细胞线粒体膜电位方面较好。⑤成功鉴定出的9个差异明显的蛋白质可能与机体的衰老关系密切,给予含红芪或含黄芪含药血清共培养后可不同程度地逆转其中部分蛋白的变化。
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