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野桑蚕(Bombyxmandarina)是属于鳞翅目的一种野生昆虫,又称野蚕。野桑蚕地理分布范围广泛,中国、日本、朝鲜、韩国等国家分布较多,俄罗斯和印度亦有少量分布。目前国内外对野桑蚕的研究报道还较少。 卵生昆虫在发育过程中,卵黄原蛋白受体(vitellogeninreceptor,VgR)通过胞吞作用介导卵母细胞对卵黄蛋白的摄取,从而为卵生昆虫的发育提供营养来源。到目前为止,已经有15种昆虫的卵黄原蛋白受体的cDNA及基因组序列被测定,它们都属于低密度脂蛋白受体家族,具有共同的保守功能域结构。 本文通过已经解析的家蚕、柳蚕及其他昆虫的卵黄原蛋白受体的cDNA序列,通过设计多对特异性引物,经PCR法扩增,克隆,测序,拼接获得野桑蚕卵黄原蛋白受体基因的全长cDNA序列。该序列全长5861bp,其中包含一个154bp的5′端非编码区,一个274bp的3′端非编码区,一个5433bp的开放读码框,该序列编码1811个氨基酸,预测蛋白分子量约为202.6kDa。系统进化分析表明野桑蚕VgR氨基酸序列与柳蚕VgR的同源性最高,高达99.7％。 利用ScanProsite在线软件分析野桑蚕卵黄原蛋白受体(VgR)蛋白功能域,选取其中两个配体结合域进行特异性PCR扩增,产物连接至质粒pET-28a表达载体,分别构建重组质粒pET-28a-BmaLBD1和pET-28a-BmaLBD2并转化感受态细胞BL21(DE3),采用不同浓度的IPTG诱导其原核表达。经SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析表明,被诱导的目的蛋白均得到正确表达,重组蛋白分子量大小分别为22.1kDa和44.7kDa。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化并制备多克隆抗体,获得的抗体效价为12800。 提取野桑蚕上蔟期的卵巢,脂肪体,马氏管,表皮,头,中肠6个不同组织的总蛋白和总RNA,通过免疫印迹法和半定量PCR法分析野桑蚕VgR在不同组织中的表达分布情况。结果表明野桑蚕VgR只特定在卵巢和脂肪体组织中表达。 根据半定量PCR结果提取野桑蚕化蛹后第一天蛹到第七天蛹脂肪体组织的总蛋白和总RNA。通过荧光定量PCR和免疫印迹法分析野桑蚕VgR在蛹期脂肪体组织的表达水平,结果表明野桑蚕VgR在蛹期第三天表达量最高。 野桑蚕是桑树的主要叶部害虫之一,同时鳞翅目昆虫又是农业和森林害虫的主要类群,是杀虫剂的主要作用对象。对野桑蚕VgR的研究有助于深入了解鳞翅目害虫生殖的分子机制,为农业生产探求合理的害虫防治方法提供理论基础,对防治新途径以及新一代环保型农药的开发都具有一定意义。