论文部分内容阅读
食用菌作为生物反应器生产外源蛋白是近年来新兴的研究热点,而利用植物系统大规模生产具有医用价值的蛋白质、多肽或者抗体等药物一直是人们的梦想,转基因植物的快速发展使这一梦想逐渐变成现实。相较于其他生物反应器系统而言,食用菌和植物可以以农业规模生产重组蛋白,排除产品被内毒素或以人病原体污染的危险；另一方面是生产疫苗类等重组蛋白时,可以不加工或部分加工后被采用。碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种多功能生长因子,它在血管形成、参与组织创伤修复过程,调节免疫功能等方面有着巨大的临床应用前景。目前,bFGF蛋白的表达主要是在原核系统中进行,本研究拟探索利用转基因金针菇和番茄表达bFGF,为利用食用菌和植物作为反应器表达外源蛋白奠定了基础,同时,也为bFGF的产业化生产提供了理论依据。实验结果如下：1.构建了植物双元表达载体p139035S-bFGF,并将重组质粒转入到根癌农杆菌EHA105中2.以白金针菇Flammulina velutipes菌丝球为受体材料,通过根癌农杆菌介导法转入bFGF。金针菇菌株对潮霉素(Hyg)抗性结果表明,在PDA固体培养基上的潮霉素筛选浓度为9μg/mL,在液体培养基中为6μg/mL。本文探索头孢霉素(Cef)对菌丝的毒性实验、农杆菌的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)的添加及其浓度的控制、共培养的时间等因素对转化效率的影响。结果表明：1)Cef对金针菇菌丝几乎无抑制作用,最佳抑菌浓度为400μg/mL;2)农杆菌的菌液浓度OD600为0.5,侵染时间在30min左右,在AS为200μmol/L的共培养基上共培养72h,转化率最高；3)PCR与Southern杂交结果表明bFGF基因已整合到金针菇的基因组中；4)在无选择压力的PDA固体培养基上继代培养五次后仍检测到bFGF基因的存在,表明bFGF基因在转基因金针菇中可稳定遗传。3.以中蔬6号番茄为植物材料进行研究,建立了高频的番茄再生培养体系。通过农杆菌EHA 105介导将植物表达载体的T-DNA区转入到番茄基因组中,然后在含有选择抗性的培养基上培养,筛选出转化植株。最后,对转基因番茄进分子检测：1)PCR和Southern杂交结果显示目的基因已经己成功整合到番茄基因组中；2) RT-PCR表明外源基因bFGF在转录水平获得表达；2) SDS-PAGE和Western杂交结果进步证明了bFGF在番茄中有所表达。