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第一部分内质网应激与自噬在氟致SD大鼠神经毒性中的作用目的:过量氟暴露可产生神经毒性,然而其具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与自噬在氟致SD大鼠神经毒性中的作用,从而为阐明氟神经毒性机制提供基础依据。方法:40只SPF级Sprague-Dewley(SD)大鼠(180~220 g),随机分为4组:对照组(水氟含量<1 mg/L)以及水氟含量为10、50、100 mg/L氟化钠(sodium fluoride,NaF)组,每组10只。各组大鼠通过自由饮水方式进行染毒,每天观察其进食、饮水等一般情况,并记录体重。染毒2个月后,通过Morris水迷宫实验检测各组大鼠的学习及记忆能力;尼氏染色观察大鼠海马组织病理改变;电子透射显微镜观察大鼠海马组织超微结构;Western blot检测大鼠海马及皮层组织ERS及凋亡的关键蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶-12(cysteine containing aspartate specific protease-12,Caspase-12)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶-3(cysteine containing aspartate specific protease-3,Caspase-3)以及自噬关键蛋白选择性自噬接头蛋白P62/sequestosome 1、自噬体形成相关蛋白Beclin1及微管相关蛋白轻链3-β(microtubule-associated protein 1 light chain3-β,LC3)的蛋白表达水平;免疫组化检测大鼠海马及皮层中GRP78、Caspase-12及LC3的定位表达情况。结果:在Morris水迷宫定位航行实验中,与同时间点对照组相比,100 mg/L NaF组大鼠游泳路程显著增加(P<0.05),且100 mg/L NaF组大鼠较对照组大鼠找到平台的平均潜伏期显著延长(P<0.05);在空间探索实验中,100 mg/L NaF组大鼠穿越原平台所在位置的次数明显少于对照组(P<0.05);此外,50和100mg/L NaF组大鼠在原平台所在象限的活动时间(路径)与总时间(总路径)比值均明显低于对照组(P<0.05)。尼氏染色结果显示,对照组大鼠海马组织CA3区神经元内尼氏小体数量丰富,而随着NaF剂量的增加,海马CA3区神经元内尼氏小体数量明显减少。电子透射显微镜显示对照组海马神经元核大,以常染色质为主,而NaF组可见核皱缩,边界不规则,染色质浓集,并出现大量自噬小体及肿胀的内质网。Western blot结果显示,与对照组相比,50及100 mg/L NaF组大鼠海马中GRP78蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而各NaF组大鼠皮层中GRP78的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);各NaF组大鼠海马中IRE1α的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而50及100 mg/L NaF组大鼠皮层中IRE1α的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);此外,各NaF组大鼠海马中Cleaved caspase-12的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而50及100 mg/L NaF组大鼠皮层中Cleaved caspase-12的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);各NaF组大鼠海马及皮层中Cleaved caspase-3的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与对照组相比,50及100mg/L NaF组大鼠海马中自噬关键蛋白Beclin1、P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著升高(P<0.05);50及100 mg/L NaF组大鼠皮层中Beclin1以及各NaF组大鼠皮层的P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示,随着NaF剂量的增加,大鼠海马及皮层GRP78、Caspase-12及LC3蛋白的阳性细胞数均多于对照组,且随着NaF剂量的增加,上述蛋白的阳性细胞数增多。结论:氟暴露可致SD大鼠神经系统损伤,损害大鼠学习记忆能力。此外,氟暴露可引起SD大鼠海马及皮层发生ERS,并激活ERS介导的凋亡通路。同时,氟暴露还可促进SD大鼠海马及皮层自噬体形成,但抑制自噬体降解,因此导致了SD大鼠海马及皮层自噬流异常。综上所述,ERS及自噬参与了氟致SD大鼠神经系统的损伤过程。第二部分ERS及其介导的自噬在氟致SH-SY5Y细胞毒性中的作用目的:研究ERS及其介导的自噬在氟致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞毒性中的作用,为探索氟致神经毒性机制提供线索。方法:SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度NaF(0、10、20及30 mg/L),通过Western blot技术检测ERS及凋亡的关键蛋白GRP78、IRE1α、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、Caspase-3,以及自噬关键蛋白Beclin1、P62及LC3的蛋白表达水平。ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)、自噬抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin,Wort)、氯喹(chloroquine,CQ)或自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)提前处理细胞1 h后,NaF染毒24 h,然后通过Western blot技术检测ERS及凋亡的关键蛋白GRP78、IRE1α、CHOP、Caspase-3,以及自噬关键蛋白Beclin1、P62及LC3的蛋白表达水平,采用免疫荧光技术检测各组LC3荧光斑点聚集,并通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各组细胞存活率。结果:Western blot结果显示,与对照组相比,30 mg/L NaF组中细胞中GRP78、IRE1α、Cleaved caspase-3、Beclin1及LC3-(40)(40)的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而20及30 mg/L NaF组细胞中CHOP及P62的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。4-PBA干预NaF染毒SH-SY5Y细胞后发现,与NaF组相比,4-PBA+NaF组细胞中IRE1α、CHOP、Cleaved caspase-3、P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。用自噬抑制剂干预后发现,与NaF组比较,Wort+NaF组细胞中P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而CQ则进一步加剧因NaF暴露而导致的P62及LC3-(40)(40)蛋白表达的升高(P<0.05);自噬激动剂Rapa干预NaF染毒SH-SY5Y细胞后发现,与NaF组比较,Rapa+NaF组细胞中P62蛋白表达水平显著降低,而LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。免疫荧光发现各组LC3荧光斑点聚集情况与各组LC3蛋白表达水平相一致。CCK-8法检测上述各种干预后细胞存活率发现,4-PBA干预可显著升高NaF组细胞存活率(P<0.05),此外,自噬干预剂Wort,CQ干预可显著降低但Rapa干预可显著升高NaF组细胞存活率(P<0.05)。结论:一定剂量NaF可致SH-SY5Y细胞发生ERS及自噬流受损,抑制自噬致细胞存活率降低,而激活自噬可促进细胞存活。此外,NaF引起的SH-SY5Y细胞ERS介导了自噬流受损的发生,抑制ERS可提高细胞存活率。