盐腺是泌盐盐生植物中最重要的离子排出器官，这种结构主要分布在植物的叶表面等地上部分器官，在调节体内离子平衡、维持渗透压稳定及提高泌盐盐生植物的耐盐性等方面发挥重要作用。目前，对植物盐腺的泌盐机理研究大多还停留在解剖学和生理学研究水平，盐腺发育及泌盐的分子机理研究相对滞后。如果能够揭示植物盐腺的发育和分泌的分子机制，克隆关键基因并最终培育具有泌盐能力的作物，对于开发利用盐碱地具有重大意义。　　二色补血草是一种典型的泌盐盐生植物，具有多细胞盐腺结构，是研究双子叶植物盐腺的理想材料。因此，研究二色补血草盐腺的泌盐特征和分子机理具有重要意义。　　本研究创建并优化多种实验方法应用于二色补血草盐腺泌盐机理的研究。首先，利用荧光显微镜发现，二色补血草盐腺细胞团的外壁层在330～380 nm的紫外光激发下具有独特的自发荧光现象，可以作为研究盐腺分布、形态及突变体筛选的简便、可靠手段；其次，本研究优化建立了一套不受外界干扰、利用一个叶片即可测定不同处理下盐腺离子分泌的二色补血草叶圆盘分泌模型，适用于二色补血草盐腺分泌特征分析，叶圆盘的参数为：叶圆盘直径12 mm，溶液离子浓度100～300 mmol L-1，分泌时间24 h，分泌温度20～25℃，光照条件12 h光照+12 h黑暗（光照强度1000μmol m-2 s-1），溶液酸碱度pH=5～6.5；第三，本研究初步获得了二色补血草盐腺酶解分离方案：酶解液（0.1％果胶酶Y-23，1%崩溃酶，1%纤维素酶，pH=5.7），抽真空10分钟，30℃黑暗，30 rpm酶解，将酶解得到的大块碎渣轻柔研磨，然后利用100μm、70μm和40μm滤器依次过滤，将盐腺用20μm滤膜收集，为进一步研究不同盐腺细胞表达谱等奠定了基础；第四，本研究成功的将由TRV病毒诱导的植物基因瞬时沉默技术（VIGS）移植到二色补血草盐腺泌盐研究中，筛选出最佳的条件为：8周龄幼苗，侵染农杆菌浓度为OD600=0.8，侵染检测期为侵染6天。　　本研究利用离子色谱技术探索二色补血草叶片及盐腺离子分泌特征，采用不同盐溶液处理，对二色补血草内部和盐腺分泌的离子进行检测，力求获得二色补血草离子分泌的种类、选择性和离子之间彼此作用的特征。结果表明，二色补血草盐腺具有施加某种离子增强分泌某种离子的特点，分泌的阳离子主要包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+和NH4+，分泌的阴离子主要包括Cl-、NO3-、SO42-、Br-、PO33-、NO2-、草酸根、甲酸根、乙酸根与柠檬酸根；二色补血草叶片内部主要检测出的阳离子为Na+、K+、Ca2+、Mg2+以及NH4+，阴离子为甲酸根、乙酸根、草酸根、柠檬酸根、SO42-、Cl-、NO3-和NO2-，二色补血草对一价碱土阳离子和卤素阴离子具有优先吸收和外排能力；在不同盐溶液处理下，二色补血草的Na+/K+维持在2.5以下，且K+没有大量通过盐腺分泌流失，说明二色补血草的耐盐机制主要是通过盐腺把吸收的过多离子分泌到体外而不是区域化到液泡中；虽然二色补血草盐腺具有施加某种离子增强分泌某种离子的特点，但其盐腺的泌盐作用具有显著的离子选择性：对阳离子分泌选择性为Na+≥K+>Mg2+>Ca2+>NH4+，对阴离子分泌的选择为 Cl-≥Br->SO42-=NO3-=NO2-=乙酸根>草酸根=甲酸根>柠檬酸根，并且二色补血草盐腺分泌的总阴、阳离子电荷基本是等量的；阴离子对二色补血草盐腺Na+分泌的促进作用为Cl-=Br->NO3-=SO42->柠檬酸根，阳离子对二色补血草盐腺Cl-分泌的促进结果为Na+≥K+>Ca2+≥Mg2+，一价碱土阳离子和卤素阴离子在二色补血草盐腺分泌中彼此促进；NaCl处理可以增加二色补血草叶片汁液中Ca2+浓度，Ca2+对二色补血草Na+分泌具有促进作用，二价阴离子和有机酸根在盐腺分泌中主要起到平衡电荷的作用。　　目前对于植物激素和盐腺分泌之间关系的研究较少，本研究发现40 mg L-1 GA3处理和60 mg L-1 ABA处理可以明显的降低二色补血草Na+分泌速率，对于进一步深入研究 GA3和 ABA在二色补血草盐腺泌盐过程的作用机理奠定了基础。　　针对二色补血草盐腺的研究发现，二色补血草盐腺分泌 Na+受到 Na+/K+ATPase、H+-ATPase、Na+/H+逆向转运蛋白（SOS1）和Na+:K+:Cl-共转运体（NKCC抑制剂）furosemide、vanadate、amiloride和 bumetanide的影响。因此我们推测编码这些跨膜转运体的基因可能参与二色补血草盐腺泌盐过程，利用实时定量PCR技术分析了可能与二色补血草泌盐相关基因质膜H+-ATPase、NKCC、SOS1和二色补血草ENA同源片段的基因表达与盐腺Na+分泌之间的关系。结果发现， H+-ATPase随外源（0～300 mmol L-1）NaCl处理浓度的升高表达量逐渐增强，与盐腺Na+分泌速率呈现线性正相关关系(R2=0.99)，在40 mg L-1 GA3处理和60 mg L-1 ABA处理时表达量明显降低，说明H+-ATPase与激素处理导致Na+分泌速率降低相关；本实验利用免疫组化技术发现NKCC定位于盐腺，在200 mmol L-1 NaCl处理下免疫组化信号增强，同时发现NKCC抑制剂bumetanide不仅抑制盐腺Na+的外排也抑制K+的释放，NKCC的表达量随外源（0～300 mmol L-1）NaCl处理浓度的升高表达量逐渐增强，与盐腺 Na+分泌速率呈现正相关关系(R2=0.97)，在40 mg L-1 GA3处理和60 mg L-1 ABA处理中表达量明显减低，与激素处理Na+分泌速率的变化趋势相一致。SOS1的表达量随外源（0～300 mmol L-1）NaCl处理浓度的升高表达量有略微增加的趋势，说明SOS1在盐腺分泌中起到一定作用，但是没有H+-ATPase和NKCC那样明显，在40 mg L-1 GA3处理和60 mg L-1 ABA处理中SOS1并没有体现出与Na+分泌速率相关的规律性变化，说明SOS1的表达量并没有通过这两种激素的路径调节；二色补血草ENA同源序列的表达量无论在NaCl处理还是激素处理中，表达量都呈现组成型特征。说明NKCC和H+-ATPase是调控二色补血草Na+分泌的关键基因，SOS1和 ENA可能参与了二色补血草的泌盐过程，但不是调节Na+分泌的关键因子。　　本实验成功地利用TRV介导的VIGS方案获得了三组NKCC基因瞬时沉默的二色补血草叶片，其基因表达量为对照的60.3～75.1%，瞬时NKCC基因沉默的二色补血草叶片盐腺的Na+分泌速率为空白对照的52%～67.5%，Cl-分泌速率为空白对照的59.1%～68.1%，下降趋势明显。这些结果进一步说明NKCC是参与二色补血草盐腺泌盐的关键基因。　　以上结果说明NKCC和H+-ATPase是调控二色补血草Na+分泌的关键基因， SOS1和ENA可能参与了二色补血草的泌盐过程，但不是调节Na+分泌的关键因子。　　为了获取更多的二色补血草泌盐相关基因以及探索泌盐相关基因调控模式，本研究成功建立起二色补血草对照与200 mmol L-1NaCl处理下叶片数字基因差异表达谱，获得了大量的信息。初步分析表明，200 mmol L-1NaCl处理下叶片许多抗性响应基因（如盐和低温响应蛋白）表达都显著升高，说明这些基因可能参与了诸如泌盐等耐盐相关响应。微管组成的基因α-Tubulin表达量也明显升高，说明了由α-Tubulin表达量增强带动植物体内微管的变化可能与泌盐活动的囊泡化转运相关。此外我们还发现200 mmol L-1NaCl处理下二色补血草叶片糖类代谢基因和膜脂去饱和相关基因的表达都有升高，从另一方面可以验证二色补血草叶片盐腺泌盐活动为耗能的主动运输过程及需要位于细胞膜系统的转运体参与的观点。这些结果为进一步研究二色补血草盐腺泌盐分子机制奠定了基础。　　本论文主要创新点：　　1首次利用离子色谱技术对二色补血草的盐腺的分泌物进行定性和定量分析，发现二色补血草对一价碱土阳离子和卤素阴离子具有优先吸收和外排能力且二色补血草盐腺分泌的总阴、阳离子电荷基本是等量的，并首次在植物盐腺分泌物中检测到甲酸根、乙酸根、柠檬酸根以及 NH4+，补充了对植物盐腺分泌离子种类的认识；　　2首次验证了编码质膜Na+: K+: Cl-共转运体和H+-ATPase的基因是调控二色补血草Na+分泌的关键基因，SOS1和ENA可能参与了二色补血草的泌盐过程，但不是调节Na+分泌的关键因子；　　3首次将基于病毒的植物瞬时基因沉默方案移植到二色补血草盐腺研究中，并获得 Na+: K+: Cl-共转运体瞬时基因沉默植株，基因表达量为对照的60.3%～75.1%。Na+: K+: Cl-共转运体基因瞬时沉默造成二色补血草盐腺分泌Na+分泌速率降低为对照的52%～67.5%和Cl-降低为对照的59.1%～68.1%。表明VIGS是研究盐腺泌盐基因的良好工具；　　4目前对于植物激素对植物盐腺泌盐的研究较少，本研究首次发现赤霉素和脱落酸对二色补血草盐腺泌盐及盐腺发育具有影响，并验证赤霉素和脱落酸影响二色补血草的Na+分泌作用是通过影响H+-ATPase和Na+:K+:Cl-共转运体表达量而实现的；　　5首次构建二色补血草对照与200 mmol L-1NaCl处理下的数字基因差异表达谱，并获得了大量的基因差异表达数据，为未来筛选更多的泌盐相关基因奠定基础。