论文部分内容阅读
目的:使用链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病大鼠模型,探讨细胞型Fas相关死亡域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达以及c-FLIP介导坏死性凋亡通路在糖尿病肾病发病机制中的作用。方法:雄性成年SD大鼠,标准化喂养。实验分为糖尿病肾病模型组(DN)和正常对照组(NC),DN组采用链脲菌素(STZ)55mg/Kg腹腔注射造模,每组2、4、8、12、16周5个观察点,每个时点6只大鼠。处死前采取血液、尿液标本,检测血糖、血清肌酐、血清尿素氮和24小时尿蛋白定量;肾脏石蜡切片作普通病理;免疫组化、免疫印迹(WB)测定肾组织中c-FLIP、受体交互作用蛋白1(RIP1)和受体交互作用蛋白3(RIP3)表达,RT-PCR测定肾组织的c-FLIP、RIP1及RIP3 mRNA相对表达量。并分析各指标之间的相关性。结果:1.血、尿指标:1)血糖:DN组不同时间点血糖比NC组明显增加(P<0.01)。2)24小时尿蛋白:(1)DN组不同时间点尿蛋白比NC组明显增加(P<0.01)。(2)DN组尿蛋白(P<0.01)随时间不断增加,差异有统计学意义(P<0.01)。3)肾功能:(1)DN组不同时间点血清肌酐及尿素氮比NC组明显增加(P<0.01)。(2)DN组血清肌酐及尿素氮差异均无统计学意义(P>0.05)。2.肾脏病理:(1)DN组大鼠肾脏发白、肿大,可见不同程度的肾小球肥大、细胞数增多、系膜基质增多、部分肾小管扩张及空泡样变性。(2)DN组不同时间点肾重指数比NC组明显增加(P<0.01)。(3)DN组肾重指数随时间不断增加,差异有统计学意义(P<0.05)。3.免疫组化:(1)c-FLIP主要表达于肾小球和肾小管细胞中;DN组不同时间点c-FLIP的表达量比NC组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);DN组c-FLIP表达量不同时间点比较,均为2W与4W相比差异无统计学意义,8W、12W、16W显著低于2W和4W,差异有统计学意义(P<0.01),8W与12W相比差异无统计学意义,16W显著低于8W和12W,(P<0.01)。(2)RIP1和RIP3也是主要表达于肾小球细胞中;DN组RIP1和RIP3不同时间点比NC组明显增加(P<0.01);DN组以上两个指标表达量不同时间点比较,均为2W与4W相比差异无统计学意义,8W、12W、16W显著高2W和4W,差异有统计学意义(p<0.01),8w与12w相比差异无统计学意义,16w显著高于8w和12w,差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05)。(3)dn组c-flip蛋白表达量与rip1、rip3呈显著负相关(r=-0.933,p<0.01;r=-0.954,p<0.01),与尿蛋白、肾重指数、血清肌酐及尿素氮均也呈负相关(r=-0.945,p<0.01;r=-0.922,p<0.01;r=-0.543,p<0.01;r=-0.494,p<0.01)。4.免疫印迹:(1)dn组不同时间点c-flip的表达量比nc组明显减少,差异有统计学意义(p<0.01);dn组c-flip表达量不同时间点比较,均为2w与4w相比差异无统计学意义,8w、12w、16w显著低于2w和4w,差异有统计学意义(p<0.01),8w与12w相比差异无统计学意义,16w显著低于8w、12w,(p<0.01)。(2)dn组rip1和rip3不同时间点比nc组明显增加(p<0.01);dn组以上两个指标表达量不同时间点比较,均为2w与4w相比差异无统计学意义,8w、12w、16w显著高2w和4w,差异有统计学意义(p<0.01),8w与12w相比差异无统计学意义,16w显著高于8w和12w,差异有统计学意义(p<0.01)。(3)dn组c-flip蛋白表达量与rip1、rip3呈显著负相关(r=-0.985,p<0.01;r=-0.986,p<0.01),与尿蛋白、肾重指数、血清肌酐及尿素氮也呈负相关(r=-0.930,p<0.01;r=-0.907,p<0.01;r=-0.575,p<0.01;r=-0.558,p<0.01)。5.real-timepcr:(1)dn组不同时间点c-flipmrna相对表达量比nc组明显减少,差异有统计学意义(p<0.01);dn组c-flip表达量不同时间点比较,均为2w与4w相比差异无统计学意义,8w、12w、16w显著低2w、4w,差异有统计学意义(p<0.01),8w与12w相比差异无统计学意义,16w显著低于8w和12w(p<0.01)。(2)dn组rip1和rip3不同时间点比nc组明显增加(p<0.01);dn组以上两个指标表达量不同时间点比较,均为2w与4w相比差异无统计学意义,8w、12w、16w显著高2w和4w,差异有统计学意义(p<0.01),8w与12w相比差异无统计学意义,16w显著高于8w和12w,差异有统计学意义(p<0.01)。(3)dn组c-flipmrna相对表达量与rip1、rip3呈显著负相关(r=-0.805,p<0.01;r=-0.869,p<0.01),与尿蛋白、肾重指数、血清肌酐及尿素氮也呈负相关(r=-0.877,p<0.01;r=-0.895,p<0.01;r=-0.643,p<0.01;r=-0.499,p<0.01)。结论:1.糖尿病大鼠肾组织中c-FLIP的表达量减少,并与糖尿病肾组织损伤有关;2.糖尿病大鼠肾组织中细胞坏死性凋亡标志物RIP1和RIP3表达增加,坏死性凋亡途径的激活可导致肾脏组织损伤;3.c-FLIP的表达量与RIP1和RIP3呈负相关,糖尿病肾病时,c-FLIP在肾脏中的低表达可能引起坏死性凋亡途径的激活,进而导致肾脏组织损伤。