研究背景吸入性损伤是由于吸入高温和含有化学物质的气体引起的呼吸道及肺实质的损伤。其多发生于大面积烧伤患者,尤其是当患者伴有头面部烧伤时。吸入性损伤是热力和化学物致病因素的混合损伤。吸入性损伤的主要因素之一是热力因素,主要损伤部位是呼吸道及肺。吸入性损伤可以引起严重的并发症,主要是肺部系统疾病,如系统性全身炎症反应和慢性阻塞性肺疾病等。当大面积烧伤伴有吸入性损伤时,可导致急性呼吸衰竭,其死亡率要远远高于单纯性烧伤。目前,在吸入性损伤中,针对烟雾及化学物质对吸入性损伤的研究比较常见,对于单纯热力对呼吸道的吸入性损也一直是研究的热点。烧伤伴吸入性损伤后,肺部受到刺激产生的炎症瀑布反应,进而引起肺部炎症的发生,是烧伤病人后期产生全身炎症反应,脓毒血症以及器官衰竭的起始机制。同时,热应激以及炎症反应也会通过不同的分子机制引起支气管细胞的凋亡以及死亡,进一步加重肺部的损伤。在吸入性损伤中,热力引起支气管上皮细胞炎症以及凋亡的现象和机制仍不是很清楚。线粒体是细胞的能力工厂,线粒体钙通道蛋白(MCU)能够影响细胞的代谢。在炎症反应中,MCU如何感受炎症反应并通过Ca2+来影响细胞的生物代谢机制仍不清楚。该研究首先在体外人支气管上皮细胞以及动物模型上观察热应激对炎症反应以及凋亡的影响,然后用多种方法研究了不同的分子机制。最后,在明确热应激能够引起线粒体改变和产生ROS基础上,着重研究在炎症反应中MCU如何感受ROS作用并调节细胞代谢,阐明了新的机制,为临床烧伤吸入性损伤治疗提供新的靶点和机制。第一部分CFTR调节的MAPK/NF-κB通路在热力性损伤肺部炎症的作用方法:1.建立体外细胞升温模型,52℃处理5分钟,热处理后在0小时,8小时,1天,2天,5天,RealtimePCR和蛋白电泳检测CFTR和COX2的表达变化。2.建立大鼠体内动物吸入性损伤模型,热处理后0小时,8小时,1天,2天,5天,免疫组化和蛋白电泳检测CFTR和COX2的表达变化。3.体外细胞升温模型中,热处理后在0小时,8小时,1天,2天,5天,蛋白电泳检测MAPK和p-IκBα的表达变化。细胞免疫荧光检测NF-κB定位变化。4.体外细胞升温模型中,NF-κB抑制剂(BAY11)ERK抑制剂(PD98059)及JNK抑制剂(SP600125)处理16HBE细胞4小时,然后再进行热处理。Realtime-PCR和蛋白电泳检测COX2的表达变化。ELISA检测细胞上清液中炎症因子PGE2的变化。5.用CFTR的下调表达质粒(Rib)转染16HBE细胞下调CFTR的表达,蛋白电泳检测COX2,NF-κB,PERK,PJNK的表达。再用ERK,JNK,NF-KB的特异性抑制剂(BAY11,PD98059,SP600125)处理PEF和RIB处理后的16HBE细胞,蛋白电泳和ELISA检测炎症因子COX2和PGE2的上升表达。6.分别用过表达CFTR的质粒p-hCFTR和VX-809转染预处理16HBE细胞细胞,再进行体外升温模型,蛋白电泳检测COX2,NF-κB,PERK,PJNK的表达。ELISA检测细胞上清液中炎症因子PGE2的变化。7.在细胞升温模型中,用ERK,JNK特异性抑制剂(PD98059,SP600125)处理细胞,然后观察p-IκBα的变化。也用NF-κB的特异性抑制剂(BAY11)处理16HBE细胞,蛋白电泳检测P-ERK及P-JNK的变化。8.热应激处理细胞以及CFTR的下调表达质粒(Rib)转染下调CFTR,同时用ERK,JNK,NF-κB,COX2的特异性抑制剂(BAY11,PD98059,SP600125,NS-398)以及VX-809处理16HBE细胞。RealtimePCR检测炎症因子IL-8的表达变化。用ELISA检测细胞上清液中炎症因子IL-8的变化。9.体外热处理16HBE细胞,处理前及处理后0.5小时,8小时用姜黄素处理细胞,Elisa检测上清液中的IL-8和PGE2的变化。在大鼠体内动物吸入性损伤模型中,鼻腔滴入姜黄素10mg/kg/天,HE染色以及髓过氧化物(MPO)免疫组化检测大鼠肺部炎症的变化。10.在大鼠体内动物吸入性损伤模型中,鼻腔滴入姜黄素10mg/kg/天,免疫组化和蛋白电泳检测CFTR和COX2的表达。ELISA检测组织匀浆液中IL-8和PGE2的变化。结果:1.体外细胞升温模型中,温度处理后,CFTR的蛋白在0小时,8小时,1天,2天表达降低,1天时下降到最点,而于5天时表达到正常水平。COX2的蛋白表达呈现出持续上升,1天时达到最高点。2.大鼠体内动物吸入性损伤模型中,肺部组织支气管细胞CFTR的表达在8小时和1天的时候表达逐渐降低,而对应的时间点COX2的表达逐渐升高。在第5天CFTR及COX2表达均恢复到了正常。3.热处理后能够激活PERK,PJNK的表达,并且在0小时达到最高峰。而对ERK,JNK和P38,PP38没有影响。而蛋白p-IκBα的表达在0小时,8小时,5天没有明显变化,而在1天和2天时达到了最高峰。免疫荧光结果显示,在1天和2天的时候,NF-κB的表达从细胞核外转移到了细胞核内。4.在蛋白水平,单独或者混合使用BAY11,PD98059,SP600125抑制剂分别能够炎症因子COX2的上升。ELISA结果表明,单独或者混合使用BAY11,PD98059,SP600125抑制剂分别能够抑细胞分泌的炎症因子PGE2。说明ERK,JNK以及NF-κB在热引起的炎症通路是在一条通路上起着关键作用。5.在正常16HBE细胞中,Rib转染组降低CFTR的表达后,Rib转染组COX2 RNA表达也明显高于PEF组。蛋白电泳结果也显示CFTR的下调表达激活了COX2,NF-κB,PERK,PJNK的表达。并且ERK,JNK,NF-κB的特异性抑制剂(BAY11,PD98059,SP600125)能够降低CFTR下调后炎症因子COX2和PGE2的上升表达。6.蛋白电泳结果显示,过表达CFTR(p-hCFTR)和VX-809处理组(1um或者3um)都能够使热刺激后的CFTR表达回升,也能够降低在升温后COX2的表达。ELISA结果也显示,升温后的PGE2在VX809(1um或者3um)处理后也明显降低。7.在细胞升温模型中,ERK,JNK特异性抑制剂(PD98059,SP600125)能够降低热应激引起的p-IκBα上升,NF-κB的特异性抑制剂(BAY11)对热应激引起的P-ERK及P-JNK升高没有影响。8.Realtime PCR和Elisa结果显示,细胞升温后和RIB质粒(降低CFTR的表达)转染后,炎症因子IL-8明显上升,并且,ERK,JNK,NF-κB,COX2的特异性抑制剂(BAY11,PD98059,SP600125,NS-398)能够降低IL-8的表达。VX809也能够降低热引起的IL-8炎症因子的分泌。9.体外热处理16HBE细胞,处理前及处理后0.5小时,8小时用姜黄素处理细胞,姜黄素能够降低炎症因子PGE2,IL-8的分泌。同时,我们用姜黄素治疗吸入性损伤的大鼠,HE结果显示,姜黄素能够明显降低热引起的炎症反应。通过髓过氧化物(MPO)免疫组化发现姜黄素处理组的髓过氧化物酶(MPO)阳性细胞明显少于升温组。10.在大鼠体内动物吸入性损伤模型中,鼻腔滴入姜黄素10mg/kg/天,免疫组化结果和蛋白电泳结果表明,姜黄素能够升高吸入性损伤中降低的CFTR表达,而同时也能够降低COX2的表达,最终能够降低IL-8和PGE2的分泌。第二部分热通过内质网应激和自噬诱导呼吸道上皮细胞炎症方法:1.建立体外细胞升温模型,在0小时,12小时,1天,2天,用DCFH-DA染色细胞内活性氧,免疫荧光检测细胞内的活性氧含量变化。2.体外细胞升温模型中,在0小时,12小时,1天,2天,蛋白电泳检测内质网应激的蛋白GRP78和CHOP,内质网应激通路PERK/eIF2α,IRE1/XBP1s和ATF6的变化。3.热应激后,在0小时,12小时,1天,2天,5天,蛋白电泳检测LC3,P62,Beclin1的变化。用LC3-GFP-mRFP腺病毒检测热应激后16HBE细胞中自噬流的变化。4.热应激后,在0小时,12小时,1天,2天,5天,Realtime-PCR和ELISA检测炎症因子TNF-ɑ,IL-6,IL-10和TGF-β变化。5.在体外细胞升温模型中,用活性氧的清除剂(NAC)处理16HBE细胞,蛋白电泳检测内质网应激的蛋白GRP78和CHOP和内质网应激通路PERK/eIF2α的变化。再用活性氧的清除剂(NAC),内质网应激的抑制剂(GSK2656157),eLF2ɑsiRNA以及内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin)处理16HBE细胞,蛋白电泳检测LC3,P62,Beclin1的变化。6.分别用活性氧的清除剂(NAC),内质网应激的抑制剂(GSK2656157),eLF2ɑsiRNA,CHOP siRNA以及ATF4 siRNA抑制内质网应激,Beclin1 siRNA,和ATG5 siRNA分别抑制自噬反应,Realtime-PCR和ELISA检测热引起的炎症因子的变化。结果:1.体外细胞升温模型中,16HBE细胞内受到热应激后,在0h,12h以及1d的时候,活性氧含量都明显升高。但第2天的活性氧含量水平确又恢复至正常。2.热刺激能够引起细胞内的GRP78和CHOP表达升高,而且在第12小时的时候达到高峰,其水平第2天逐渐降到正常。磷酸化的PERK和elF2α同样在第12小时达到高峰,并且在第2天逐渐恢复。然而,IRE1,XBP1s和ATF6的蛋白表达在热刺激后并没有明显变化。3.热应激后,自噬的指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1在第1天和第二天明显升高,并在第5天将到正常水平。相反,P62的表达随着温度处理的时间逐渐降低,在第1天和2天达到最低值,而在第5天达到最高值。激光共聚焦结果也显示,自噬流在热处理后的第1天和2天也明显升高,而第5天降至正常范围。4.热应激后,Realtime-PCR结果显示,在细胞RNA水平上,TNF-ɑ,IL-6,IL-10,TGF-β的RNA表达在第1天和2天上升到最高值,第5天逐渐回复到了正常。在细胞培养上清中,TNF-ɑ,IL-6,IL-10,TGF-β在第1天和第2天明显升高,并且在第5天恢复至正常。5.热应激后,活性氧的清除剂(NAC)能够降低内质网应激的蛋白GRP78和CHOP的表达记忆内质网应激通路PERK/eIF2α的激活。活性氧的清除剂(NAC),内质网应激的抑制剂(GSK2656157),eLF2ɑsiRNA能够抑制热应激引起的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin1增加以及P62表达减少。6.Realtime-PCR和ELISA结果显示,NAC,GSK2656157,eLF2ɑsiRNA,CHOP siRNA,ATF4 siRNA,Beclin1 siRNA,和ATG5 siRNA能够减轻热应激刺激16HBE引起的TNF-ɑ,IL-6,IL-10,TGF-β的RNA表达和细胞因子分泌。第三部分热通过激活线粒体钙通道蛋白(MCU)引起支气管上皮细胞凋亡方法:1.建立体外细胞升温模型,在受热刺激后的0小时,1天,2天以及5天的时候,用CCK8检测细胞活力。流式细胞仪检测细胞凋亡。蛋白电泳检测检测凋亡蛋白Bcl2及Bax。2.用mitotracker标记线粒体,激光共聚焦下观察热刺激后线粒体形态的变化。3.膜片钳检测热刺激后MCU通道活性。激光共聚焦实时动态检测热刺激后线粒体MCU对钙离子的摄取能力变化。4.Rhod-2 AM+标记线粒体的基础钙,激光共聚焦下记录线粒体的基础钙储存量。PTI(Photon Technology International)仪器测定细胞对钙的摄取和基础钙量。5.ATP试剂盒检测热刺激后细胞ATP的变化。Seahorse检测热刺激后细胞基础耗氧量和最大耗氧量的变化。6.Mitosox标记线粒体的ROS,激光共聚焦检测热刺激以及RU360处理后细胞线粒体的ROS变化。ELISA检测细胞内硝酸酪氨酸(Nitrotyrosine),4-羟基壬希醛(4-Hydroxynonenal),过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量。7.用Calcein-AM标记线粒体通透性转换孔,激光共聚焦检测热刺激后线粒体膜通透性的变化,用TMRE标记线粒体膜电位,激光共聚焦检测热刺激后线粒体膜电位的变化。8.RU360抑制剂或者线粒体ROS抑制剂Mito Tempo处理16HBE细胞,在热刺激后,用CCK8检测细胞活力。流式细胞仪检测细胞凋亡。蛋白电泳检测检测凋亡蛋白Bcl2及Bax。结果:1.细胞活力在热处理后的第1,2天明显降低,在第5天恢复至正常。细胞流式结果显示凋亡细胞的比例在热处理后第1,2天达到最高峰,在第5天降至正常。Bcl-2/Bax比例在热处理后的第1天和2天降到最低值,第5天也恢复至正常。2.激光共聚焦显示热刺激能使线粒体呈现应激状态,线粒体形状由线状长条状变成圆状,并且排列松散。3.膜片钳结果,与未处理组相比,热处理组IMCU电流的强度明显升高,说明热能够提高线粒体的MCU的离子通道开放程度。激光共聚焦实时动态监测显示,热处理后细胞对Ca2+的摄取斜率明显高于未处理组及RU360处理组。4.热处理后16HBE细胞内的Ca2+荧光强度明显高于未处理组。PTI显示热处理后细胞线粒体对Ca2+的摄取明显高于未处理组及RU360处理组,并且,热处理后细胞线粒体内Ca2+的储存量也明显高于未处理组及RU360处理组。5.热处理后,会使细胞的ATP代谢明显降低,而当用RU360抑制剂处理后,降低的ATP又会上升。并且,热刺激后细胞的基础耗氧量和最大耗氧量明显降低,RU360抑制剂处理后,热降低的基础耗氧量和最大耗氧量上升。6.热处理组mitoSOX染色明显高于未处理组,而当加入RU360后,mitoSOX染色明显降低。热应激后,16HBE内硝酸酪氨酸(Nitrotyrosine),4-羟基壬希醛(4-Hydroxynonenal),过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量硝酸酪氨酸(Nitrotyrosine)硝酸酪氨酸(Nitrotyrosine)明显高于未处理组及RU360处理组。7.热处理后,会使细胞线粒体膜电位明显降低和线粒体通透性转换孔开放,用RU360抑制剂或者线粒体ROS抑制剂Mito Tempo处理后,线粒体膜电位明显升高和线粒体通透性转换孔开放程度降低。8.RU360或Mito Tempo处理后,细胞活力明显上升,细胞凋亡减少,Bcl-2/Bax比例降低。全文总结1.在16HBE细胞受到热刺激以及吸入性损伤动物模型中,热刺激能够引起炎症因子COX2和PGE2上升。也能够引起炎症的TNF-ɑ,IL-6,IL-10,TGF-β产生。2.热应激通过CFTR/MAPK/NF-κB/COX2信号通路调节炎症因子的产生。3.热应激通过ROS/内质网应激/自噬信号通路调节炎症因子的产生。4.热应激能够通过激活MCU,进而引起细胞线粒体钙超载,线粒体膜电位降低以及能量代谢改变引起细胞凋亡。