塑化剂又称增塑剂,常被当作添加剂而广泛的应用工业加工和各种生活消耗品中。例如现实生活中的塑料产品、建筑材料、化妆品和一些医疗耗材都含有一定量塑化剂。DEHP全名“邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯”是塑化剂的主要成分之一。研究表明DEHP可以通过各种途径迁徙进入水、土壤和空气等环境中,进而暴露于人体。大量的流行病学调查和研究表明,DEHP作为一种环境内分泌干扰物质经常暴露可能对人体的健康产生各种潜在毒性危害。在疾病的基础上,长期暴露DEHP甚至可能会出现加速疾病病程的进展现象。酒精性脂肪肝是由于长期过度饮酒导致肝脏脂质代谢紊乱,肝细胞脂肪代谢减少,积累增多,同时伴有肝细胞炎性损伤的一种慢性疾病。酒精性脂肪肝是酒精性肝病的最早期表现,也是最容易被忽视的阶段,往往大的疾病正是由一些基础疾病慢慢演变成大的隐患,所以酒精性脂肪肝值得我们重视。研究发现DEHP对肝脏的毒性可能与细胞DNA损伤、氧化应激、脂质过氧化和炎症反应等有关。迄今为止关于DEHP对酒精性脂肪肝的影响鲜有人研究。根据大量文献报道,细胞色素P4502E1和沉默信息调节因子-1与酒精性脂肪肝的发生密切相关,参与肝脏脂质代谢、氧化应激和炎症反应的调节,可能是乙醇作用与肝脏的重要靶点。本研究结果显示,DEHP可以促进酒精性脂肪肝大鼠肝功能损害和病理性损伤。DEHP暴露显著加速了肝细胞内脂肪变性和促进肝细胞活性氧的产生,破坏肝脏氧化与抗氧化体系平衡,加重氧化应激损伤;同时参与调节脂质代谢途径的相关蛋白SIRT1、CYP2E1受到影响,与肝脏炎症反应和氧化应激相关通路蛋白P-p38、P-p65被上调。值得注意的是,在LO-2细胞实验结果中观察到的趋势与体内结果基本一致。总的来说,研究显示DEHP可能是通过CYP2E1,SIRT1和p38MAPK/NF-κB信号通路加速或加重大鼠酒精性脂肪肝疾病的进展。研究目的:采用酒精结合高脂饮食诱导大鼠脂肪肝化模型建立,研究DEHP对酒精性脂肪肝大鼠不同时期(2、4、8周)的病理过程影响。检测DEHP对酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影响。初步探究DEHP对酒精性脂肪肝的毒性机制。同时在体外实验利用人正常肝细胞(LO-2)进一步探讨SIRT1、CYP2E1和p38MAPK/NF-κB信号通路在慢性酒精诱导的脂肪肝中的作用。研究方法:体内实验中,我们利用酒精灌胃结合特定高脂饲料诱导SD大鼠脂肪肝化的模型,诱导模型的同时给予灌胃低、中、高三种浓度DEHP(0.05、5、500 mg/kg),设置灌胃DEHP 500mg/kg作为对照组,加上正常组共计六组。上午灌胃DEHP,下午灌胃酒精一直持续八周时间;分别在两周、四周和八周末严格按照动物伦理学方法处死大鼠。肝组织HE染色、油红O染色和MASSON染色分别观察DEHP对不同时期酒精诱导的脂肪肝大鼠肝脏病理变化;以大鼠肝脏重量和体重计算对应的肝指数;试剂盒对血清中谷氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的活性进行分析;再分别定量测出肝脏组织匀浆中甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)的含量,计算组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力高低;免疫印迹法(Western blotting)检测组织中SIRT1、CYP2E1、P-p38和P-p65蛋白的表达;激光共聚焦观察肝组织中SIRT1和CYP2E1的表达分布情况。体外细胞实验中,同样设置六组:正常组,乙醇组(100mmol/L),乙醇+DEHP(6.25、25、100μmol/L),DEHP 100μmol/L对照组。体外培养48h后,首先采用CCK-8试剂盒检测DEHP对LO-2细胞活力的影响;体外脂质堆积实验中,以无水乙醇(100mmol/L)联合油酸(90μmol/L)共同刺激48小时建立体外脂质堆积模型,分为:正常组,乙醇组,乙醇+DEHP 6.25μmol/L组,乙醇+DEHP25μmol/L,乙醇+DEHP 100μmol/L,DEHP 100μmol/L对照组;采用DCFH-DA荧光探针标记LO-2细胞中活性氧,流式细胞仪检测DEHP处理后细胞中ROS含量。提取细胞蛋白,免疫印迹法(Western blotting)检测SIRT1、CYP2E1、P-p38和P-p65蛋白的表达。研究结果:1.DEHP暴露对大鼠肝功能指标和肝脏组织中氧化还原平衡体系的影响接触DEHP后,大鼠肝脏指数被明显升高;生化指标检测中,血清ALT和AST活性水平显著上升。肝脏组织匀浆中,中、高剂量DEHP组,检测甘油三酯(TG)含量明显增加;DEHP可以显著抑制慢性酒精诱导的脂肪肝大鼠肝脏中SOD的活性,同时升高组织中MDA的含量。提示DEHP摄入促进酒精性脂肪肝大鼠的肝脏损伤,氧化性损伤严重,可能与肝脏内氧化与氧化防御系统的平衡被打破相关。2.DEHP暴露对酒精性脂肪肝大鼠的组织病理变化第二、四和八周,宏观观察各组新鲜肝脏样本无明显差异。第二周各组HE染色显示,除酒精联合DEHP高剂量组血管附近出现轻微炎性细胞浸润。第四周HE结果中,酒精组、DEHP低中剂量组伴有少量淋巴细胞浸润和轻微炎症,DEHP高剂量组胞质出现少许脂肪液泡,炎症浸润明显。第八周HE和油红O染色结果表明,长期暴露于DEHP中可能会加重慢性酒精诱导的脂肪肝大鼠肝脏脂质蓄积、炎症损伤和细胞坏死。分析Masson胶原染色发现,酒精联合DEHP500 mg/kg组血管周围出现毛刺状胶原纤维的浸润,存在轻中度纤维化症状。提示DEHP暴露下,可加速酒精性脂肪肝大鼠的病理进程甚至加重疾病的发展。3.Western blot法分析DEHP对肝组织中SIRT1、CYP2E1、P-p65、P-p38蛋白表达的影响相比正常组,酒精组和DEHP对照组的CYP2E1,SIRT1,P-p38和P-p65水平有明显变化。与模型组比较,DEHP中、高剂量处理后,CYP2E1被明显激活,P-p38和P-p65蛋白表达增高。DEHP 500mg/kg+酒精组中SIRT1蛋白表达被抑制。提示DEHP对酒精性脂肪的影响可能与CYP2E1、SIRT1和P38MAPK/NF-κB信号通路关系密切。4.免疫荧光法检测DEHP对肝组织中SIRT1、CYP2E1蛋白表达变化采用激光共聚焦显微镜拍摄肝组织中CYP2E1、SIRT1蛋白表达和分布;结果表明,DEHP能显著促酒精性脂肪肝大鼠肝组织中CYP2E1蛋白的表达,抑制SIRT1表达,其中是酒精+DEHP 500mg/kg组最明显。5.DEHP对正常人肝细胞活力和无水乙醇刺激下细胞中ROS水平的影响研究结果中,乙醇可以显著影响LO-2细胞活力。随着DEHP暴露浓度的增加,细胞活力下降幅度加大。提示DEHP可抑制乙醇诱导下的细胞增殖。通过流式细胞仪检测活性氧的荧光强度发现,中、高浓度DEHP暴露大幅提高了LO-2细胞中活性氧的含量。6.无水乙醇刺激下DEHP对LO-2细胞中CYP2E1,SIRT1,P-p38和P-p65蛋白含量的影响数据显示,体外实验的总体趋势与动物实验结果基本一致,DEHP能显著促进CYP2E1,P-p38和P-p65蛋白的表达,抑制SIRT1蛋白含量。其中乙醇联合DEHP100μmol/L组最明显。7.DEHP对体外LO-2细胞脂质堆积的影响研究结果显示,油红O染色后,在倒置显微镜下,红色脂质聚集在细胞膜周围。随着DEHP暴露的增加,膜附近脂质的聚集也增加。在DEHP高剂量组中,红色脂质沉积更广泛,脂质含量最高,最严重。结论:1.通过对第2、4和8周的实验研究中,我们发现长期摄入中、高浓度的DEHP会显着促进或加重大鼠酒精性脂肪肝的发生和发展。2.DEHP暴露显著增加酒精性脂肪肝大鼠肝功能损伤。3.DEHP暴露可显著促进肝细胞内脂质堆积,增加肝细胞活性氧的产生,破坏肝脏氧化与抗氧化体系平衡,不断加重肝脏氧化损伤。4.结合体内、体外实验结果暗示,DEHP对酒精性脂肪肝的加重影响,可能与上调CYP2E1,p38MAPK/NF-κB的水平并抑制SIRT1信号通路相关联。