目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的微血管并发症之一。也是导致晚期肾功能衰竭的主要病因。目前尚缺乏早期诊断DN的指标。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte FABP, A-FABP或FABP4)是FABPs家族的一员,是成熟脂肪细胞胞质的重要蛋白,主要参与细胞内脂质的代谢,可与脂肪酸结合,增强游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)的可溶性,促进FFA转运。长链脂肪酸、胰岛素和过氧化物酶增殖因子活性受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)激动剂可诱导FABP4的表达。由于长链脂肪酸及其代谢产物在信号传导通路中起一级或二级信号作用,因而FABP4可能以FFA为配体,在转移脂肪酸的同时起信号转导作用。有研究表明循环FABP4浓度在代谢综合征和2型糖尿病等脂质代谢紊乱性疾病中明显升高,认为FABP4在上述疾病的发生发展过程中发挥作用,并能预测这些疾病的发展。本实验首先采用免疫组化和Western blot法检测FABP4在正常Wistar大鼠各组织中的分布、定位和定量。之后,动态观察STZ诱发1型糖尿病大鼠空腹血清FABP4、FFA的改变;进而观察糖尿病肾组织FABP4蛋白含量变化,试图探讨FABP4作为糖尿病肾病早期生物标记物的可行性。方法:1正常大鼠FABP4在各组织的分布、定位和含量正常清洁级Wistar大鼠雌雄各8只。取雌雄各5只大鼠,用4%多聚甲醛行全身灌流固定后,取脑、眼、心、肺、肝、肾、脂肪、骨骼肌、小肠、胰腺、膀胱、卵巢和睾丸组织置于4%多聚甲醛固定,用于HE染色和FABP4免疫组化染色。其余雌雄各3只大鼠处死后,取心、肺、肝、肾、脂肪、骨骼肌、小肠、胰腺、膀胱、卵巢和睾丸组织提取蛋白做FABP4 western blot分析。2建立1型糖尿病大鼠模型并动态检测空腹血清FABP4、FFA、血脂的变化。正常清洁级Wistar大鼠雄性14只,随机分为对照组(C组)5只和糖尿病组(DM组)9只。左侧单肾切除一周后,以60mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(STZ),制造1型糖尿病大鼠模型。对照组左侧单肾切除一周后腹腔注射同体积枸橼酸缓冲液。72h后测尾尖静脉血血糖,血糖≥16.7mmol/L者确定为DM模型制作成功。分别于3天,1,2,4,8,12周收集24小时尿,用Elisa法检测24h尿白蛋白。1,2,4,8,12周取空腹末梢静脉血(眼内眦静脉),离心后取血清,-20°C保存。集中统一测定FABP4、FFA、血糖(FBG)、血脂:甘油三酯(TG),总胆固醇(T-CHO)和其他血生化指标。3检测糖尿病大鼠肾脏FABP4的表达和含量变化正常清洁级Wistar雄性大鼠40只,建立1型糖尿病大鼠模型,方法同2。造模后分别于2,4,8,12周各取10只大鼠(C组4只,DM组6只),取末梢静脉血离心后取血清测量血糖。其中4只大鼠(对照组1只,病变组3只)行灌流固定后取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,用于HE、PAS和骨桥蛋白(OPN)、ED1免疫组织化学染色。其余6只(C组、DM各3只)大鼠称体重、肾重;取肾组织置于PLP固定液中固定,蔗糖溶液梯度脱水,OCT包埋,行组织冰冻切片,用于检测肾脏FABP4;取部分肾皮质用于提取蛋白做FABP4和OPN western blot分析。结果:1 FABP4在正常大鼠各组织中的表达1.1 FABP4免疫组化结果:(1)所有脂肪细胞的胞浆和胞核表达阳性。(2)多数组织毛细血管和静脉内皮细胞的胞浆和胞核FABP4表达阳性,但组织不同,内皮细胞阳性表达差异较大:脂肪、心肌、骨骼肌、小肠和胰腺均有表达;肺脏、肾脏、肝脏、膀胱、睾丸和卵巢呈区域性表达;眼和脑未见表达。(3)巨噬细胞:只有肺内巨噬细胞和少数肝脏枯氏细胞胞浆和胞核有表达。(4)其他阳性表达细胞:肾盂和膀胱的移行上皮细胞胞浆胞核、卵巢黄体细胞胞浆胞核和胰岛细胞胞浆有阳性表达。1.2 Western blot定量结果:心肌、胰腺、脂肪、肺、肾皮质、小肠、睾丸、骨骼肌、卵巢、膀胱中均有FABP4的表达。其中脂肪组织FABP4含量最多,其次是心肌,肾皮质含量较少,肝脏未见条带。2 1型糖尿病大鼠空腹血清FABP4、FFA及血脂的动态检测2.1 DM组第1周空腹FABP4即明显升高,之后各时间点均明显高于对照组(P<0.05)。2.2 DM组第1周空腹FFA即明显高于对照组(P<0.05),并持续到第12周。2.3 FBG、空腹血脂变化:DM组除第2周T-CHO与对照组无统计学差异外,其余FBG、TG、T-CHO、尿素氮(BUN)在1、2、4、8、12周均高于对照组。2.4 DM组从3天起,24h尿白蛋白即高于对照组,这种趋势一直持续到第8周。2.5 DM组虽然血清白蛋白(ALB)在各时间点均低于C组,但只有8周和12周差异有统计学意义(P<0.05)。2.6相关分析结果:Spearman’s相关分析显示:空腹FABP4与FFA(r=0.512, p=0.000)、FBG(r=0.434,p=0.003)、TG(r=0.360, p=0.017)、24h尿白蛋白(r=0.583,p=0.000)呈明显正相关。与血ALB (r=-0.485,p=0.001)呈负相关。与T-CHO (r=0.13, p=0.401)无关。空腹FFA与FBG(r=0.490, p=0.000)、TG(r=0.542, p=0.000)、TCHO(r=0.37, p=0.002)、24h尿白蛋白呈正相关(r=0.634, p=0.000),与血白蛋白(ALB)呈负相关(r=-0.278, p=0.002)。3 FABP4在1型糖尿病大鼠肾组织的表达及意义3.1一般参数、血糖和肾小球直径:DM组大鼠的体重在2、4、8、12周明显低于C组(P<0.05);其肾重、肾重/体重比值、血糖和肾小球直径在上述时间点均明显高于C组(P<0.05)。3.2形态学观察:HE染色显示DM组从第2周开始部分肾小管管腔出现蛋白管型,肾小管出现颗粒变性、空泡变性,第12周时这种改变最明显。PAS染色显示4周时DM组肾小球系膜基质轻度增生,8周时系膜细胞轻度增多。3.3肾小球和间质ED1阳性细胞计数:在2、4、8周,DM组肾小球内及肾皮质间质ED1阳性细胞数明显多于C组(P<0.05)。3.4 FABP4定位及定量观察:免疫组化显示第2周DM组近髓肾皮质肾小管周围毛细血管和小静脉内皮细胞FABP4阳性表达数量增多,并向肾皮质表面延伸。第4周可见部分肾小囊壁层上皮细胞胞浆和胞核及肾小球内细胞出现FABP4阳性表达。肾皮质Western blot定量结果显示,从第2周开始各时间点DM组大鼠肾皮质FABP4蛋白表达明显高于C组大鼠(P<0.05)。这种增加持续到第8周。3.5 OPN的表达:免疫组化和Western blot结果显示2、4、8周OPN在DM组和C组表达量无差别。结论:1证实脂肪细胞FABP4表达丰富,与其他学者细胞学研究结果一致;但只有肺组织中的巨噬细胞和少数肝脏枯氏细胞可见FABP4阳性表达。研究结果提示:巨噬细胞在病理状态下FABP4表达与生理状态下不一致。2首次系统观察FABP4在正常Wistar大鼠各组织中的定位及定量表达;发现多个组织的毛细血管和小静脉内皮细胞胞浆和胞核均有表达;但组织不同,内皮细胞阳性表达差异很大。这种表达差异的机制需进一步探讨。虽然文献报道认为血FABP4来源于脂肪细胞,我们的研究结果认为微血管内皮细胞也是血FABP4重要来源。3肾盂和膀胱的移行上皮细胞胞浆胞核、卵巢黄体细胞胞浆胞核和胰岛细胞胞浆FABP4表达阳性。FABP4这种分布的广泛性提示其功能的多样性。4我们发现糖尿病第1周即有空腹FABP4、FFA有意义增高,比空腹血糖值的升高更稳定,说明脂质代谢紊乱是糖尿病的早期事件,提示空腹FABP4、FFA可作为糖尿病早期诊断的指标。5 STZ诱导的1型糖尿病,在肾病早期FABP4在肾脏微血管内皮细胞胞浆和胞核的表达量即增加,并随糖尿病进展表达形式发生了改变。这种高表达持续到第8周,而作为肾小管损伤标记物的OPN,DM组表达量与对照组无差别。我们的结果证实糖尿病肾损伤早期FABP4表达增加。进一步将拟对应检测糖尿病大鼠尿中FABP4的水平改变,探讨血或尿中FABP4检测作为DN早期诊断标记物的可行性。