猪脱细胞真皮基质的制备与性能研究

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组织工程是应用生命科学与工程学原理与技术,体外或体内构建有生物学结构和功能的组织或器官替代物,以修复损伤的组织器官。支架材料是组织工程的三要素之一,本文依据组织工程对支架材料的性能要求,以制备维持胶原天然三维结构并具有理想孔结构的猪脱细胞真皮基质(PADM)为主要目的,设计了一种成本低、操作简单的制备工艺,优化了其主要工艺参数,表征了PADM的各项性能:(1)为了筛选优化PADM的制备工艺,确定制备流程中的工艺参数,实验选用在皮肤结构、生物性状和免疫组化反应特性方面与人皮肤非常相似的猪皮为原料,结合制革工艺中的预处理工艺,设计了如下制备工艺:预处理—碱处理—酶处理—SDS处理—盐处理—保存。采用控制变量法调节各种试剂的浓度和作用时间,并检测PADM的孔隙率、拉伸强度、降解速度、胶原纯度等理化性能,分析试剂浓度和作用时间对PADM各项理化性能的影响。结果表明,随着碱、酶浓度的升高、作用时间的延长,PADM的孔隙率逐渐增大,拉伸强度逐渐降低,降解速度逐渐增快;且NaCl处理能明显提高PADM的胶原纯度。根据检测结果,筛选出如下制备工艺:2.0 g·L-1 NaOH-0.8 g·L-1 SDS溶液处理15 h,3.0 g-L-1胰酶-1398酶-2.0 g·L-1 SDS溶液处理15 h,4.0 g·L-1 SDS溶液处理4h,58.5 g·L-1 NaCl溶液处理24 h。(2)以优化的制备工艺制备了PADM,并检测分析其各项性能:观察其外观形貌,检测其孔隙率、拉伸强度、体外酶降解性及透水汽性,苏本精-伊红(HE)染色观察PADM细胞去除情况,氨基酸自动分析仪分析胶原蛋白的含量,扫描电子显微镜(SEM)观察其微结构,MTT法检测小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)种植后的生长增殖情况,HE染色观察3T3细胞在PADM上的分布。结果表明PADM呈洁白色,富有弹性,韧性强,结构疏松,细胞成分去除彻底,胶原蛋白的含量达92.01%;PADM呈多孔网络结构,孔道相互连通,可观察到直径100μm左右的孔径,并较好的保持了胶原纤维束的天然结构;PADM的孔隙率为85.54%,拉伸强度为4.63 MPa,透水汽性为2923 g·m-2·24h-1,在体外胶原酶溶液中完全降解时间约为95小时;3T3细胞在PADM上贴附生长、增殖良好、分布均匀。该PADM孔隙率和拉伸强度适宜、孔结构理想、降解速度可控以及生物相容性良好,符合皮肤组织工程对支架材料的要求。(3)在模拟体液(SBF)中用羟基磷灰石(HAP)矿化PADM制备复合支架材料HAP-PADM,并检测其理化性能,分析HAP-PADM在骨组织工程中的应用:电子万能试验机检测其抗压强度,体外胶原酶溶液中测定其降解性,SEM观察其微结构,MTT法检测MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)种植后的生长增殖情况,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察MC3T3-E1细胞在PADM上的分布。结果表明HAP-PADM具有二级的多孔结构,一级结构是由PADM提供的大孔(直径约100μm),二级结构是由纳米HAP组成的小孔(直径小于100 nm);HAP-PADM的抗压强度为7.54 MPa,体外降解速度明显慢于PADM的降解速度;MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞在HAP-PADM上贴附生长、增殖良好、分布均匀。该HAP-PADM具有良好的细胞相容性,主要理化性能符合骨组织工程对支架材料的要求。
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