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脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁外膜上的主要成分,不但能够阻碍抗菌药物进入细菌内部发挥抗菌作用,而且还是引发炎症反应的主要诱因。失控的局部炎症反应会导致全身性炎症或脓毒症等疾病,对组织和器官引起不同程度的损伤,严重的甚至会导致生物体死亡。目前还没有开发出能够有效中和LPS的成熟药物。抗菌肽来源广泛,作为生物体先天免疫系统的重要成员,具有广谱抗菌活性且不易产生耐药性等特点,某些抗菌肽还具有中和LPS及调节免疫功能,是研发拮抗LPS抗炎药物的理想候选。Chensinin-1是本实验室从中国林蛙(Ranachensinensis)皮肤分泌物中分离纯化得到的一种含有18个氨基酸的短肽,该抗菌肽具有分子量小,阳离子性强等特征,对革兰氏阳性菌有较好的抗菌活性。前期研究中对chensinin-1进行改造,以疏水性较强的色氨酸替换了疏水性较弱的甘氨酸,并调整氨基酸序列增强了其两亲性得到了它的改造肽chensinin-1b,其抗菌活性尤其是对革兰氏阴性菌的抗菌能力与模板肽相比有显著的提高。本文首先研究了 chensinin-1b对革兰氏阴性菌选择性杀菌活性的分子机制。NPN检测chensinin-1b对细菌细胞壁外膜的渗透性,结果表明chensinin-1b对大肠杆菌外膜有较强的渗透能力,chensinin-1相对较弱。制备去除细胞壁外膜的大肠杆菌原生质体,两种抗菌肽对原生质体的去极化作用和抗菌活性与大肠杆菌相比均有不同程度提高,而对LPS环境中的原生质体的去极化及抗菌能力又有所下降,其中chensinin-1下降的程度较chensinin-1b 更大,说明 chensinin-1 无法像 chensinin-1b 一样作用于 LPS,提示chensinin-1和chensinin-1b对革兰氏阴性细菌抗菌活性的不同,是由于二者对革兰氏阴性菌细胞壁外膜中LPS作用程度不同引起的。等温滴定量热(isothermaltitrationcalorimetry,ITC)实验和Zeta电势实验测定chensinin-lb与LPS之间的相互作用。ITC显示,chensinin-1b与LPS的结合是一个先放热后吸热的过程,先后由焓和熵驱动。表明chensinin-1b先以静电作用和LPS吸附结合,再以疏水作用插入到LPS中。通过分析热力学参数,得出结论chensinin-1b的结合系数较大,说明与LPS有较强的结合能力,而chensinin-1较弱。Zeta电势实验从电荷补偿的方面也印证了同样的结果。动态光散射(dynamic light scattering,DLS)和FITC-LPS解聚实验显示chensinin-1b与LPS结合后,能不同程度解聚LPS聚集体,使聚合态的LPS分子粒径由大变小,有利于chensinin-1b的插入。chensinin-1b对LPS的结合和解聚作用是chensinin-1b贯穿LPS的前提,荧光光谱显示chensinin-1b的自发荧光吸收峰随着LPS浓度的升高发生了蓝移,并伴随着荧光强度的升高。淬灭剂的加入并不能完全淬灭荧光,说明chensinin-1b插入到LPS疏水内部使淬灭剂无法接触进而产生淬灭作用。原位红外光谱检测LPS内部结构发现,随着chensinin-1b作用时间的而增加,LPS内部的磷酸基团结构发生了变化,说明chensinin-1b能够通过疏水作用贯穿LPS并导致LPS的解离。鲎试剂显色实验(Limulus amebocyte lysate test,LAL)显示 chensinin-1b 可以很好的中和 LPS。LPS是炎症反应信号通路的触发剂,本文进一步研究了 chensinin-1b对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症模型的影响。结果显示chensinin-1b能够抑制LPS诱导产生的炎症因子和介质如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮(NO)的释放。chensinin-1b对炎症的抑制能力要强于chensinin-1。在对RAW264.7作用中,利用激光共聚焦显微镜观察到抗菌肽chensinin-1b能够在短时间内就进入到RAW264.7细胞内部,这意味着chensinin-1b可以在细胞内部发挥抗炎作用。我们使用chensinin-1b预处理方法考察chensinin-1b在RAW264.7细胞内部的抗炎作用,结果显示chensinin-1b的预处理能够降低炎症因子TNF-α、IL-6的含量,对炎症因子的抑制率约占正常处理组的80%以上,也就是说chensinin-1b在细胞外部中和LPS并非是它抑制炎症的主要途径,在细胞内部的作用才是chensinin-1b的主要抗炎机制。Western Blot检测了 chensinin-1b对胞浆蛋白NOD1和NOD2表达的影响,结果显示chensinin-1b可以抑制LPS诱导的NOD1和NOD2的过表达。NOD1和NOD2可激活下游的核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,使用RT-qPCR,检测到抗菌肽chensinin-1b抑制了 NOD1/NOD2介导通路蛋白NF-κB的mRNA表达,Western Blot结果表明chensinin-1b对MAPK信号通路中的主要通路蛋白ERK/JNK/p38的磷酸化水平也有显著的抑制作用。利用细胞膜去极化实验研究了 chensinin-1b的内化途径,结果表明chensinin-1b并不能引起RAW264.7细胞膜电位的变化,说明chensinin-1b是以非破膜的方式进入到细胞内部。通过研究低温和多种内吞抑制剂处理对chensinin-1b内化的影响,发现chensinin-1b是以能量依赖的形式,并通过Na+/H+离子通道介导的内吞途径为主进入到细胞内部,发挥抗炎作用。综上所述,抗菌肽chensinin-1b有效抑制LPS诱导的炎症因子和介质的释放,对LPS有较强的中和拮抗作用。但chensinin-1b中和LPS只在其抗炎活性中起一部分作用,更主要的抗炎机制是以能量依赖的Na+/H+离子通道介导的内吞途径为主进入到细胞内部,通过在细胞内部作用于胞浆蛋白NOD1/NOD2,并降低其介导的NF-κB和磷酸化的ERK/JNK/p38 的表达。