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Kappa型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)及其内源性配体强啡肽(dynorphin)广泛分布于中枢神经系统,KOR结合配体后,经典的G蛋白通路的活化与KOR镇痛功能的实现密切相关,而非G蛋白依赖性通路的激活,尤其是β-arrestin依赖的信号通路活性的明显增强,往往直接引发KOR相关的负性情绪的出现。多项研究表明,在强迫行为以及习惯行为的养成方面有着重要作用的纹状体,KOR及其配体dynorphin的显著上调已被公认为是药物成瘾的明显标志,并且上调的KOR/dynorphin系统偏向性选择β-arrestin2依赖的信号通路,参与药物滥用以及药物成瘾的形成。因此,探寻纹状体内KOR激活后偏向性选择β-arrestin依赖的通路进行信号转导的根本原因,显然成为阐明药物滥用及成瘾机制研究中亟待解决的关键问题。KOR-DOR二聚体高选择性激动剂,6’-GNTI在脊髓水平具有很强的镇痛作用,但是脑室内给药却没有相似的效应出现,同时考虑到G蛋白偶联受体(GPCR)异源二聚体存在的广泛性以及其结构、功能的特异性,我们推测在脑内极有可能存在与KOR单体或KOR-DOR二聚体的不同另外的KOR表现形式,致使KOR信号通路从G蛋白依赖的经典途径转而选择非G蛋白依赖的通路。虽然大量研究证实了神经降压素(neurotensin,NT)及其受体(neurotensin receptor 1,NTSR1)系统与阿片系统之间的功能重叠性,尤其是KOR/dynorphin系统,但尚未见有关KOR与NTSR1之间相互作用的报道。利用免疫荧光染色结合原位邻位连接技术(PLA),我们不仅发现KOR及NTSR1共定位于体外培养的纹状体神经元,并且初步鉴定KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达。本实验拟在前期工作的基础上,进一步确认KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系,并对KOR-NTSR1异源二聚体对KOR介导的信号转导的可能影响进行了研究:(1)通过构建多种KOR、NTSR1融合表达载体,瞬时或稳定转染HEK293细胞,建立KOR和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示,各受体单表达组与共表达组细胞之间,受体表达量无明显差异;同时,免疫荧光染色结合共聚焦扫描观察,发现KOR、NTSR1主要定位于细胞膜上,表达均匀。提示,细胞模型构建正确,KOR、NTSR1融合表达载体表达稳定。(2)通过SOE-PCR技术,对KORTM4区域184以及196位氨基酸进行点突变,将上述位点亮氨酸突变成丙氨酸。成功构建KOR184、KOR196突变体后,瞬时或稳定转染HEK293细胞,建立KOR184/196和/或NTSR1表达的HEK293细胞模型。通过免疫印迹分析、细胞膜表面蛋白ELISA检测显示,各单表达与共表达组细胞内,KOR184/196的受体表达量与野生型KORWT相比较,无明显差异;免疫荧光染色结合共聚焦扫描显示,各单表达与共表达组细胞内,KOR184/196主要定位于细胞膜上,表达均匀稳定,与KORWT类似。(3)经 BRET、FRET、CO-IP 分析,发现 KORWT、KOR184 能与 NTSR1 发生异源二聚化,但KOR196与NTSR1无异源二聚化相互作用,提示:KOR的196位亮氨酸是KOR-NTSR1异源二聚体形成的关键位点;同时,KOR196与NTSR1共表达的细胞,可以作为异源二聚化结合的阴性对照,应用于KOR-NTSR1异源二聚体信号转导机制的实验研究。(4)通过细胞内cAMP水平的分析发现,在KOR、KOR184、KOR196独立表达组,给予dynophinA(1-13)刺激,FSK诱导的cAMP生成均受到明显的抑制:KORWT:最大抑制率=66.5%;KR184:最大抑制率=70%;KOR196:最大抑制率=63.9%。但在KORWT/NTSR1 和 KOR184/NTSR1 共表达细胞内,dynophin A(1-13)仅引起细胞内 cAMP水平轻微下降:KORWT:最大抑制率=14.7%; KOR184:最大抑制率=14.9%,而在KOR196/NTSR1组,cAMP水平与KOR196独立表达组相近。实验表明,异源二聚化结合NTSR1之后,dynorphinA(1-13)激活KOR后,对腺苷酸环化酶的抑制作用明显减弱。(5)为了验证cAMP结果,我们通过eBRET动态监测,对KOR偶联Gi蛋白的能力进行了分析。结果发现,KORWT/NTSR1和KOR184/NTSR1共表达细胞内,给予dynophin A(1-13)刺激时,KORWT/184与Gi蛋白的结合峰值明显低于KORWT/184独立表达组,而KOR196/NTSR1共表达组内,KOR196与Gi蛋白的结合与KOR196独立表达组相似。提示,异源二聚化结合NTSR1后,给予dynorphinA(1-13)时,KORWT/184偶联Gi蛋白的能力明显下降。(6)结合BRET1和eBRET检测发现,异源二聚化结合NTSR1之后,dynorphin A(1-13)刺激下,KORWT/184与β-arrestin1/2的结合峰值明显高于KORWT/184独立表达组,说明KOR WT/184募集β-arrestin1/2的能力明显增强,表现出明显的剂量依赖性以及时程上的延长:KOR WT/184与NTSR1共表达组,KOR WT/184与β-arrestin1/2的结合可延续到给药2h,而KORWT/T84独立表达组,仅维持到30min左右。(7)对ERK1/2磷酸化水平进行免疫印迹分析发现,异源二聚化结合NTSR1之后,dynorphin A(1 -13)刺激下,KOR WT/184介导的ERK1/2磷酸化表现出明显的时程上的改变,出现给药15min之后的持续性ERK1/2活化,且该持续性的ERK1/2磷酸化(30min)表现出明显的剂量依赖性。KOR196与NTSR1共表达组,未观察到与KOR196独立表达组存在ERK1/2磷酸化在时程上的差异。(8)为了探究KOR-NTSR1所介导的持续性的ERK1/2磷酸化的诱因,我们进一步进行了 β-arrestin1/2 shRNA以及PTX干预实验。β-arrestin1/2 shRNA分析发现,虽然β-arrestin 2几乎不参加dynorphin A(1-13)激活KORWT单体后ERK1/2的磷酸化,但是,在KORWT和NTSR1共表达的HEK293细胞,在转染β-arrestin2 shRNA后,本来在30min时间点出现的较强的ERK1/2的磷酸化几乎完全消失,甚至在5min时间点的早期磷酸化也受到明显的影响,与转染control shRNA的同组细胞于相同的时间点相比较,表现出明显的削弱。通过Gi/o蛋白的选择性抑制剂PTX干预实验发现,KORWT独立表达组,PTX预孵育后,dynorphin A(1-13)诱导的早期快速磷酸化(5min时间点)几乎完全消失,而在KORWT/NTSR1共表达的细胞内,PTX对dynorphin A(1-13)诱导的早期ERK1/2磷酸化抑制率仅余40%左右。β-arrestin1/2 shRNA和PTX实验结果提示,与NTSR1发生异源二聚化结合后,KOR所介导的G蛋白依赖的信号转导通路的活性明显削弱,同时β-arrestin2依赖通路的活性明显增强,(9)通过细胞内cAMP水平的检测以及BRET分析,对于KORWT/184和NTSR1共表达的细胞,NT(8-13)单独作用时,对FSK诱导的cAMP水平的升高,没有抑制作用,同时不会引起KORWT/184偶联Gi蛋白、结合β-arrestin1/2;在给予NT(8-13)+dynorhpin A(1-13)共刺激时,KOR WT/184对cAMP生成的抑制作用、偶联Gi蛋白的能力以及募集β-arrestin1/2的能力均恢复到dynorhpinA(1-13)刺激KORWT/184独立表达组细胞的水平。即给予NT(8-13)共刺激,能有效逆转因KORWT/184-NTSR1异源二聚体形成所致的,KOR介导的腺苷酸环化酶活性抑制作用的降低、KOR偶联Gi蛋白能力的降低以及对β-arrestin1/2募集能力的显著增强。(10)通过BRET检测,给予NT(8-13)可导致KOR与NTSR1之间的异源二聚化作用明显减弱,表现为BRET值的浓度依赖性以及时间依赖性的降低。随后的PLA实验验证了 BRET结果,给予NT(8-13)刺激30min,KOR与NTSR1共表达组,代表异源二聚体多寡的PLAP阳性产物明显减少。同时,上述NT(8-13)所介导的BRET值的下降以及PLAP阳性扩增产物的减少与dynorhpinA(1-13)刺激与否无关,提示:只要NTSR1激活,KOR-NTSR1二聚体即有可能出现构象改变或两原聚体发生解聚。通过免疫印迹分析KOR和NTSR1共表达细胞内ERK1/2磷酸化,发现给予NT(8-13)共刺激时,dynorhpin A(1-13)失去诱导持续性ERK1/2磷酸化的能力,即NT(8-13)可以明显抑制dynorhpin A(1-13)刺激 KOR-NTSR1 异源二聚体时引发的 β-arrestin1/2 依赖的 ERK1/2 磷酸化,上述抑制作用表现为明显的剂量依赖性增强。该部分结果提示,NTSR1的激活与否,是决定KOR-NTSR1异源二聚体中KOR选择G蛋白依赖性或β-arrestin2依从性信号通路的关键因素。综上所述,本实验首次原代培养的纹状体神经元,证实了 KOR-NTSR1异源二聚体的内源性表达,并于转染的HEK293细胞内确认了 KOR与NTSR1之间的异源二聚化相互作用关系;通过观察与Gi蛋白、β-arrestin1/2结合能力、对cAMP抑制作用以及对ERK1/2活化等方面的研究发现,与NTSR1发生异源二聚化相互作用后,KOR介导的Gi依赖的通路明显减弱,同时非G蛋白依赖的通路,尤其是β-arrestin1/2依赖的信号转导明显增强。实验结果充分证实了 “NTSR1是纹状体内KOR的工作伙伴”的假设,本研究为纹状体内KOR偏向性选择β-arrestin依赖的通路的现象提供了坚实的实验依据,也为阐明药物滥用及成瘾的机制提供可靠的理论依据。本研究同时还发现NTSR1的激活,可以逆转基于KOR-NTSR1异源二聚化作用而发生的KOR信号通路的转换,促使KOR经由经典的Gi依赖的通路进行信号转导,该结果不仅为NT/NTSR1系统参与痛觉调制以及安定作用的实现提供了理论基础,也为充分发挥病理状态下明显上调的KOR/dynorphin系统的作用提供新的理论支持;本研究同时为药物滥用及成瘾的防治提供了新的思路,并为新型抗成瘾药物的开发提供了有效的作用靶点,具有重要的实际意义和临床应用前景。