【摘 要】
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目的:本研究探讨石蒜碱对K562细胞及伊马替尼耐药K562细胞增殖、凋亡、自噬的影响,并从自噬层面初步阐述石蒜碱逆转伊马替尼耐药慢性白血病可能的分子机制,为临床逆转慢性髓性白血病靶向药物的耐药问题提供新的思路。方法:采用梯度诱导法建立伊马替尼耐药细胞株（K562/IM）,CCK-8法检测K562细胞及K562/IM细胞对伊马替尼的敏感性及细胞形态学变化;利用生物信息学分析K562细胞与K562/I
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目的:本研究探讨石蒜碱对K562细胞及伊马替尼耐药K562细胞增殖、凋亡、自噬的影响,并从自噬层面初步阐述石蒜碱逆转伊马替尼耐药慢性白血病可能的分子机制,为临床逆转慢性髓性白血病靶向药物的耐药问题提供新的思路。方法:采用梯度诱导法建立伊马替尼耐药细胞株（K562/IM）,CCK-8法检测K562细胞及K562/IM细胞对伊马替尼的敏感性及细胞形态学变化;利用生物信息学分析K562细胞与K562/IM细胞差异基因及相关生物过程和信号通路。体外培养K562细胞,CCK-8法检测石蒜碱或石蒜碱联合伊马替尼干预K562、K562/IM细胞增殖活性;丹酰尸胺（MDC）染色法检测石蒜碱或雷帕霉素干预K562细胞自噬情况;Western blot法检测石蒜碱联合自噬激动剂或抑制剂干预K562细胞Beclin-1、Atg5、LC3、Caspase-3蛋白表达情况;生物信息学分析K562/IM细胞与石蒜碱干预K562/IM细胞的差异基因及相关的生物过程和信号通路。CCK-8法检测石蒜碱或石蒜碱联合伊马替尼及自噬激动剂/抑制剂干预K562/IM细胞增殖活性;流式细胞周期、凋亡实验检测石蒜碱干预K562细胞及K562/IM细胞凋亡率及细胞周期阻滞情况;MDC染色法检测石蒜碱干预K562、K562/IM细胞自噬情况;Western blot法检测K562细胞及K562/IM细胞P62、Beclin-1、Atg5、LC3、Bax、Bcl-2、Caspase-3、P-gp蛋白表达情况。结果:成功构建伊马替尼耐药细胞株K562/IM,CCK-8结果显示,伊马替尼处理72h后,K562/IM细胞耐药指数是K562细胞的55.86倍（P＜0.05）;显微镜观察细胞形态,伊马替尼处理72h后K562细胞出现细胞皱缩,胞浆颗粒增多,细胞体积减小,K562/IM（3μM）细胞表面光滑,细胞形态未见明显变化;生物信息学分析显示,与K562组相比,K562/IM组自噬相关基因SESN3上调,差异基因富集在自噬相关PI3K/Akt/MAPK/RAS等通路。CCK-8结果显示,石蒜碱处理24h、48h后,以剂量依赖性抑制K562细胞增殖（P＜0.05）;石蒜碱联合伊马替尼处理24h、48h、72h后,抑制K562细胞和K562/IM细胞增殖（P＜0.05）;生物信息学分析显示,与K562/IM相比,石蒜碱处理K562/IM组自噬相关基因SQSTM1（P62）上调,差异基因富集在自噬相关PI3K/Akt/MAPK等通路;MDC染色结果显示,自噬诱导剂雷帕霉素处理K562细胞24h后荧光强度增强,石蒜碱处理K562细胞24h后荧光强度减弱;Western blot结果显示,石蒜碱处理K562细胞24h后,Beclin-1、Atg5、LC3II蛋白表达量下调（P＜0.05）,Caspase-3蛋白表达量上调（P＜0.05）。CCK-8结果显示,石蒜碱处理24h、48h后,以剂量依赖性抑制K562/IM细胞增殖（P＜0.05）;石蒜碱联合伊马替尼及自噬激动剂/抑制剂处理24h、48h后明显抑制K562/IM细胞增殖,包含羟氯喹的联合用药组细胞存活率最低（P＜0.05）;流式细胞周期结果显示,石蒜碱处理24h后K562及K562/IM细胞周期分布明显阻滞于G0/G1期（P＜0.05）;细胞凋亡结果显示,石蒜碱处理24h后K562及K562/IM细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）;MDC染色结果显示,石蒜碱处理K562、K562/IM细胞72h后荧光强度减弱,K562/IM细胞荧光强度高于K562细胞;Western blot结果显示,石蒜碱处理K562、K562/IM细胞24h后,Beclin-1、Atg5、LC3-II、Bcl-2蛋白表达量下调（P＜0.05）,Caspase-3、P62、Bax/Bcl-2、Bax蛋白表达量上调（P＜0.05）,K562/IM细胞P-gp蛋白表达量下调（P＜0.05）,K562细胞未检测到P-gp蛋白。结论:1.成功构建伊马替尼耐药细胞株K562/IM,结合差异表达基因和KEGG通路富集分析提示K562细胞伊马替尼耐药机制可能与自噬有关。2.石蒜碱体外有效抑制K562细胞、K562/IM细胞增殖,细胞周期阻滞于GO/G1期,诱导细胞发生凋亡,其机制可能与下调Bcl-2的表达,刺激Caspase-3途径,从而上调Bax/Bcl-2的表达有关。石蒜碱抑制自噬从而逆转K562/IM细胞耐药性,其机制可能与下调自噬通路蛋白Beclin-1、Atg5、LC3-II和上调P62表达进而下调耐药相关蛋白P-gp表达有关。
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