本论文主要着眼于苏云金芽胞杆菌在杀虫抗病相关领域的研究,研究内容分别涉及到了该领域的多个方面:包括对具有杀虫抗病增效作用新基因的发掘,功能和作用机理研究；具有杀虫抗病增效作用新基因在苏云金芽胞杆菌中的功能验证；还有苏云金芽胞杆菌遗传操作方法的改进；以及转基因Bt工程菌的安全性问题的评估等等。主要研究内容和结果如下:　　 1)HaCadl对苏云金芽胞杆菌毒素CrylAc的增效活性及其增效机理　　 本研究将纯化的HaCadl与CrylAc毒素进行体外复配生测,发现棉铃虫受体钙粘蛋白含有毒素结合区域的片段HaCadl能够显著提高杀虫晶体蛋白CrylAc对棉铃虫的杀虫活性。本研究进一步研究了HaCadl对CrylAc毒素的增效机理,证明体外添加的HaCadl可以在中肠环境下促进毒素单体的寡聚化,这样可以提供更多的寡聚化的毒素,提高毒素与第二受体结合的比例,最终起到提高杀虫活性的功能。　　 2)苏云金芽胞杆菌毒素CrylAc与棉铃虫受体钙粘蛋白HaCad的相互作用位点　　 本研究通过构建了一系列的棉铃虫钙粘蛋白毒素结合区HaCadl的N端和C端的缺失突变体,然后对各缺失突变体采用ligand blot,GST-Pulldown和酵母双杂交等蛋白质相互作用分析技术研究了它们与CrylAc毒素的结合能力。实验结果证明HaCadl上能够与CrylAc蛋白结合的位点位于1401位到1441位之间的40个氨基酸残基内。进一步对该区域进行3个氨基酸残基的丙氨酸扫描突变实验证明其中的1416FIL1418和1422TGVLSLNFOPTAAMHGMFEF1441多肽对于受体结合毒素是必须的。同时,通过对CrylAc蛋白结构域Ⅱ内的loop-1,loop-2,loop-3和loop-α8的缺失突变体与HaCadl的ligandblot实验,证明CrylAc蛋白与HaCad结合的区域位于结构域Ⅱ内的loop-3区域。最后,通过序列比对,亲水性互补分析和三维结构对接模拟进一步证实CrylAc结构域Ⅱ中loop3的区域440FSNSSVSII448和受体HaCad上的1423GVLSLNFQP1431区域是发生相互作用的核心区域。　　 3)稻瘟菌蛋白类激发子MgApl诱导植物抗病活性和作用机理　　 本研究在大肠杆菌中表达和纯化了稻瘟菌蛋白类激发子MgApl,通过室内盆栽抗病等实验证明了MgApl具有蛋白类激发子的功能,能够诱导包括水稻,番茄和土豆等多种植物产生对多种细菌和真菌病害的抗性。进一步发现MgApl蛋白能够诱导番茄叶片中抗病相关酶的积累和活性的显著提高。通过RT-PCR检测发现MgApl蛋白能够诱导水稻叶片中抗病相关基因PRs表达的上调,而且这种上调现象具有可传导性和长达15 d的持效期。说明MgApl蛋白诱导植物产生的抗性是一种系统获得抗性SAR。之后通过对SAR各条信号传导途径的标志基因和条信号传导途径的突变体等试验进一步证明了MgApl主要是通过水杨酸途径来进行SAR的信号传导。此外还证明MgApl的诱导过程还与钙离子通道和活性氧的进发有关。　　 4)稻瘟菌蛋白类激发子MgApl增强AiiA蛋白和ZwA的抗病活性　　 本研究通过将S-层表面展示系统在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中成功表达了稻瘟菌蛋白类激发子MgApl,并通过室内盆栽和离体抗病试验证明了MgApl具有诱导番茄抗病相关酶活性提高和诱导马铃薯抗软腐病等生物学功能。本研究进一步探索了稻瘟菌蛋白类激发子MgApl、AiiA蛋白与ZwA之间进行联合抗病的可能性。将MgApl、AiiA蛋白的编码基因slh-mgap1和pro3a-aiia同时导入到高产ZwA的蜡状芽胞杆菌UW85中,得到了同时表达MgApl、AiiA蛋白与ZwA的重组菌。室内盆栽结果发现共表达重组菌获得了MgApl的诱导活性,Aii活性检测发现重组菌也获得AiiA蛋白对AHLs信号分子的降解活性。同时ZwA活性检测发现共表达并不影响重组菌中ZwA的产量。最后,离体抗病实验证明三者在芽胞杆菌中共表达能够极大地提高重组菌对软腐病菌SCG1的防治效果。　　 6)苏云金芽胞杆菌工程菌BMB696B和BMB606B的安全性毒理学评估　　 本研究按照《农药登记毒理学实验方法》GB15670-1995上规定的关于生物农药的毒理学内容和方法,完成了工程菌BMB606B和BMB696B的急性和亚急性毒性,眼和皮肤刺激性以及过敏性等毒理学试验。结果证明工程菌BMB696B和BMB606B及其产品对雌、雄性大鼠(Wistar)急性经口LD50大于5000 mg/kg,属低毒类；对雌雄大鼠急性经皮LD50大于2000 mg/kg,属低毒类；对兔眼刺激积分指数为0,刺激平均指数48 h后为0,眼刺激强度为无刺激性；对雌雄大鼠经过多次致敏和激发均没有发现对封闭群豚鼠有皮肤的致敏反应,属Ⅰ级弱致敏物；经28 d致病性观察,在经口剂量5000 mg/kg情况下,对雌雄Wistar大鼠体重,取食,饮水,血常规和血清学指标以及器官发育均无明显影响,说明两株工程菌产品对受试动物无致病作用。本研究证明工程菌BMB696B和BMB606B及其产品对所试动物无毒、无刺激性、无致敏性、无致病性,是值得进一步开发应用的安全可靠的生物杀虫剂。　　 6)苏云金芽胞杆菌野生菌和大质粒高效电转化体系的建立　　 本研究通过DNA脱盐技术处理外源DNA,加入细胞壁弱化剂弱化苏云金芽胞杆菌的细胞壁,并对各种影响电转化效率的因素的条件优化,建立了一套苏云金芽胞杆菌的高效电转化体系。与已报道的最佳的电转化程序比较,结果证明:本研究优化的电转化系统使BMB171的电转化效率提高了104倍；利用本研究优化的电转化系统对多株以前无法转化的野生菌株进行了有效的转化,解决了Bt工程菌构建的技术瓶颈；同时,该转化体系还能够将以前无法转化的大质粒(>20 kb)成功导入到BMB171中,并且在国际上首次成功电转化了60kb的大质粒,为在Bt中进行大片段的基因操作(如基因簇的克隆和异源表达)提供了有效的手段。