论文部分内容阅读
油菜菌核病(Sclertinia sclerotiorum (Lib) de Bary)是一种世界性病害,各油菜生产国均有发生,历来深受科研人员的高度重视,从分子水平研究菌核病致病机理是油菜菌核病研究的一个重要方面。本研究以油菜抗病相关的Unigene库/cDNA文库及其芯片表达谱结果为基础,首先利用荧光定量PCR法验证cDNA芯片杂交结果中部分抗病相关基因表达模式。以此研究为依据,选择了3个与油菜抗菌核病相关的基因,构建干扰载体,从病原诱导表达测定、转基因功能鉴定的角度研究了这些基因的功能。初步结果表明基因AT-29、AT-30和AT-10与菌核病抗性相关,为油菜抗病相关基因。研究获得的主要结果如下：1. cDNA芯片验证。利用荧光定量PCR法验证cDNA芯片杂交结果中部分抗病相关基因表达模式。结果显示：Real time PCR检测结果与cDNA芯片杂交结果中基因的表达趋势基本一致,说明cDNA芯片结果可靠。2.通过amiRNA干扰技术鉴定油菜同源基因AT-29、AT-30和AT-10的功能。在基因功能研究中,人工miRNAs (artificial miRNAs, amiRNAs)干扰技术是一种新型的、高效的、高通量的基因沉默新技术,因此本文采用amiRNA技术鉴定基因Bn-29、Bn-30和Bn-10的功能。本研究基于油菜菌核病抗性相关基因芯片表达谱分析结果,选择了3个受菌核病特异诱导表达上调的基因Bn-29、Bn-30和Bn-10作为研究对象。根据这些侯选基因的拟南芥同源基因AT-29、AT-30和AT-10的序列,设计靶序列,通过overlapping PCR的方法构建amiRNA干扰载体；获得经PCR检测为阳性的转基因拟南芥。首先利用荧光定量PCR检测转基因植株中目的基因的表达,结果表明：导入amiRNAs干扰载体的转基因株系中,目的基因AT-29、AT-30和AT-10的表达量均显著降低,转基因植株中表达量均被抑制了近50%,最高抑制了88%,达到了理想的干扰效果。此外利用荧光定量PCR检测拟南芥转基因植株防御标记基因PDF1.2(茉莉酸信号传导途径标志基因)和PR1(水杨酸信号传导途径标志基因)的表达,结果显示：转基因植株中标记基因PDF1.2和PR1的表达量降低了近50%,最高降低了90%；AT-29、AT-30和AT-10转基因植株中基因PDF1.2和PRl的表达量均低于野生型。说明防御标记基因PDF1.2和PR1在转基因植株中显著降低。转基因植株活体接核盘菌鉴定表明,发现内源基因AT-29、AT-30和AT-10表达被显著干扰后,拟南芥对核盘菌的敏感性表现显著增强。以上结果说明了AT-29、AT-30和AT-10基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性密切相关。