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目的通过构建慢病毒载体,探究体外沉默NMⅡ基因表达对大鼠DRGs神经元细胞的影响。方法针对NMⅡ基因构建不同干扰效率的大鼠NMⅡsi RNA表达质粒,分别为空白对照组、空质粒组、siRNA1组、siRNA2组及siRNA3组,并使用慢病毒包装系统,转染至大鼠DRGs神经元细胞中。(1)通过Rt-PCR及Western Blot技术检测转染后神经元细胞内NMⅡ基因mRNA及其蛋白的表达情况,探究体外基因沉默NMⅡ的效率;(2)采用扫描电子显微镜技术,直接观察NMⅡ基因沉默后神经元生长锥的结构。结果成功构建了大鼠含NMⅡsiRNA的慢病毒颗粒。各组NMⅡsiRNA均能够顺利转染入神经元细胞。结果表明,siRNA3组体外沉默大鼠DRGs细胞NMⅡ基因的效率达80%以上;si RNA1组沉默效率约为30%;siRNA2组的沉默效率约为60%。RT-PCR结果显示,siRNA3组中大鼠神经元细胞的NMⅡmRNA的表达量明显低于其它4组,差异具有统计学意义(p<0.05);Western blot的结果表明,siRNA3组中大鼠DRGs细胞的NMⅡ蛋白的表达量较其它4组明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05);扫描电镜结果显示:在空白对照组及空质粒组中,神经元细胞内线粒体形态完整,髓鞘排列整齐,细胞间桥粒清晰可见,轴突中的微管结构排列整齐,可观察到较为完整的生长锥结构。而在siRNA3组中,可见神经元轴突内的微管结构排列紊乱,大部分细胞溶解,细胞器肿胀崩解,神经纤维脱髓鞘,未见正常的生长锥形态。结论(1)成功设计、筛选出了1对沉默效率最高的NMⅡsiRNA片段,并成功构建了慢病毒载体;(2)慢病毒载体介导的siRNA能够感染大鼠DRGs细胞并高效沉默NMⅡ基因的表达;基因沉默NMⅡ导致了DRGs细胞生长锥细胞骨架结构的改变,引起了生长锥的塌陷,表明NMⅡ是调控生长锥骨架结构,促进轴突再生的有效靶点。