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研究目的:难治性肾病综合征(RNS)的表现为激素抵抗、激素依赖或反复复发,其预后差,易发展为终末期肾病(ESRD)。RNS发病机制还不完全清楚,目前认为多种因素均可导致其发生,其中遗传因素在难治性肾病综合征(RNS)的发生发展中起着重要作用。我们前期在局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)家系中发现一个FSGS新的候选致病基因—ARHGAP32基因(c.1213C>G,p.Leu405Val)杂合突变,可能是该家系FSGS的发病原因。本项目是在此基础上,通过体内外研究,初步探讨ARHGAP32表达变化及突变导致足细胞损伤的机制,为RNS发病机制研究及新的治疗措施提供新思路。同时继续对RNS患者进行致病基因筛查和验证,期望检测出与RNS相关的变异,以利于临床诊断、治疗和预后。研究方法:(1)通过体内外实验对ARHGAP32基因突变进行功能研究,研究其蛋白表达水平;构建Arhgap32基因点突变小鼠后,尾静脉注射阿霉素建立Arhgap32基因L405V点突变小鼠的肾脏损伤模型,收集其尿液、血液及肾组织标本,检测相关生化指标和病理分析;检测足细胞的标志物Nephrin和Synaptopodin的表达,研究ARHGAP32基因突变对足细胞的影响;初步探讨ARHGAP32基因突变导致足细胞损伤的机制。(2)对收集的RNS患者进行全外显子测序,生物信息分析,筛查可能致病基因突变,并利用SIFT,Polyphen-2和Mutation Taster等软件预测其致病性,分析致病突变与疾病的关系。研究结果:(1)免疫组织化学染色结果显示Arhgap32基因突变小鼠肾组织中均有蛋白表达。阿霉素诱导Arhgap32基因的L405V点突变小鼠后出现体重增长减缓、蛋白尿的现象,血肌酐和尿素氮的含量升高,同时肾组织出现肾小球系膜细胞增生等肾脏病理损害,其足细胞标志物Nephrin和Synaptopodin表达降低,出现足细胞损伤。对可能影响的Rho GTPase家族成员Rac1、RhoA和CDC42检测其表达,发现突变小鼠的Rac1、RhoA和CDC42表达升高。(2)经外显子测序和生物信息学分析在2例RNS患者中发现1例RNS患者存在DGKE基因突变(c.1448A>G,p.Tyr483Cys)和TTC21B基因突变(c.1609T>G,p.Leu537Val)。另1患者发现ANLN基因c.2428C>T(p.Arg810Cys)和c.2521G>A(p.Glu841Lys)突变及CD2AP基因c.1488G>T(p.Met496Ile)突变。这5个错义突变均为杂合突变,经软件预测后均有致病性,为RNS候选致病基因。研究结论:本研究通过对前期在家族性FSGS发现的ARHGAP32基因(c.1213C>G,p.Leu405Val)突变进行功能研究显示,ARHGAP32基因在肾组织中均有高表达。ARHGAP32基因突变通过上调Rac1、RhoA和CDC42,引起足细胞损伤,导致蛋白尿发生,从而造成肾脏损害,甚至发展为FSGS,初步探讨了ARHGAP32基因突变导致足细胞损伤的机制。除此之外,本研究还首次报道RNS患者可能存在两个或多个基因的致病性突变,仍需进一步探讨其可能的协同致病机制。因此,本研究为更好的诊断、治疗及预后提供了可靠依据。