【摘 要】
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昆虫的生殖对于维持昆虫种群至关重要,其中,雌性昆虫的生殖调控机制一直都是昆虫学领域内的研究热点。过去的研究表明,不同昆虫的生殖调控机制存在很大差异,而目前只在模式昆虫中有较系统的研究。MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号途径是进化过程中高度保守的胞内信号转导途径,对于哺乳动物的生殖发育具有重要作用,然而在昆虫雌性生殖调控中的作用尚不清楚。因此,本研究以十
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目(31972268);
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昆虫的生殖对于维持昆虫种群至关重要,其中,雌性昆虫的生殖调控机制一直都是昆虫学领域内的研究热点。过去的研究表明,不同昆虫的生殖调控机制存在很大差异,而目前只在模式昆虫中有较系统的研究。MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号途径是进化过程中高度保守的胞内信号转导途径,对于哺乳动物的生殖发育具有重要作用,然而在昆虫雌性生殖调控中的作用尚不清楚。因此,本研究以十字花科蔬菜重要害虫大猿叶虫Colaphellus bowringi为研究对象,探究MAPK信号途径在其雌性生殖中的功能和分子机制,主要结果如下:1.大猿叶虫MAPK信号途径候选基因的克隆与序列分析本研究首先克隆鉴定了17个候选基因,来自ERK(extracellular regulated protein kinase)、JNK(c-Jun N-terminal kinase)与P38(P38 MAPK)途径,即MAPK信号途径中最为重要的3条途径。系统进化树分析表明候选基因均与鞘翅目昆虫的亲缘程度最高,结构域比较后发现候选基因所编码的蛋白质与其它物种的相应蛋白质结构域高度保守。2.大猿叶虫MAPK信号途径关键基因的RNAi筛选在雌虫3日龄蛹期注射dsRNA沉默上述17个候选基因,以卵巢发育等级为指标,结果发现只有沉默MEK(MAPK-ERK kinase)、ERK、KSR2(kinase suppressor of RAS 2)、PFN(profilin)与P38这5个基因可以抑制卵巢发育。因此,将上述5个基因作为大猿叶虫雌虫生殖调控的关键基因,进行后续研究。3.大猿叶虫MAPK信号途径关键基因的时空表达检测4日龄大猿叶虫雌成虫中头部、脂肪体、中肠和卵巢组织中的关键基因表达量,发现关键基因均在卵巢中高表达。关键基因在0,2,4日龄的卵巢中表达模式不同,MEK与P38在0日龄表达量最高,ERK与PFN表达量基本不变,KSR2则在4日龄具有表达高峰。时空表达模式暗示关键基因在卵巢发育中发挥了重要作用,但作用时间不同。4.MAPK信号途径关键基因对大猿叶虫雌虫存活与生殖的影响(1)通过RNAi试验明确各关键基因对大猿叶虫卵巢发育的影响,包括卵巢发育等级分析,卵巢长宽测定和q RT-PCR检测卵黄原蛋白合成基因的表达水平。结果表明:关键基因MEK、ERK、KSR2、PFN与P38对卵巢发育至关重要,可能通过影响卵黄发生调控卵巢发育。(2)沉默关键基因后每日统计存活率与产卵量,结果表明:关键基因可以显著降低雌成虫寿命与产卵量,说明关键基因对于大猿叶虫雌成虫的存活与生殖力至关重要。(3)注射商品化的ERK途径特异性抑制剂U0126,结果发现:U0126处理后对于大猿叶虫的存活与卵巢发育均没有影响,推测该抑制剂在大猿叶虫中缺乏活性。5.MAPK信号途径关键基因对大猿叶虫雌虫的激素信号、细胞周期与生殖干细胞的影响以关键基因ERK、PFN与P38分别代表ERK、JNK与P38途径,探究其调控大猿叶虫雌虫生殖的分子机制,结果表明:(1)沉默ERK和PFN后显著下调了蜕皮激素合成基因的转录水平,而对于保幼激素合成酶的表达均无影响;进一步切断保幼激素信号后发现,ERK表达量显著下调,暗示了保幼激素通过ERK途径调控大猿叶虫生殖。(2)沉默ERK后下调了细胞周期中复制前期关键调控因子cyclin D(CCND)的表达,但是对细胞核大小无影响;沉默PFN后DNA复制相关基因表达量下降且细胞核核直径减小,说明ERK途径影响了复制前期而JNK途径影响了复制期。(3)沉默ERK、PFN与P38都降低了生殖干细胞指示基因的表达,暗示它们在大猿叶虫雌虫生殖干细胞的发育与分化中具有潜在的功能。综上所述,本研究利用RNAi技术筛选发现了MAPK信号途径基因MEK、ERK、KSR2、PFN与P38显著影响大猿叶虫雌虫的存活、卵巢发育与产卵。其中ERK和JNK途径可能参与了蜕皮激素合成与细胞周期的调控,而P38途径可能只影响了生殖干细胞的发育与分化过程。我们的研究为深入理解雌虫生殖调控机制提供了新的线索,为害虫绿色防控提供了新的分子靶标。
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