索法酮及其类似物对吡虫啉的增效机制

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使用化学农药是控制农作物有害生物严重危害的重要手段,但农田害虫种群在杀虫剂胁迫下会产生适应性,连续不断重复使用单一农药产品会使害虫种群进化出抗药性,并最终导致防治失败。为保障可持续的农产品生产,抗药性已成为目前生产上有害生物综合治理面临的严峻挑战。对于产生高水平抗性的药剂种类,不得不暂停使用,替换使用无交互抗性的药剂或研发与应用新型药剂品种。但在目前普通发生多药抗性的情况下,新型替代药剂的研发越来越困难,这就需要有新的思维来解决日益突出的抗药性问题。抗性机制研究表明,很多害虫产生抗药性的分子机制是由于害虫体内解毒酶基因表达水平上调,导致对杀虫剂的解毒能力提高,而许多解毒酶基因的表达则受到转录因子CncC等的调控。医学研究表明可通过抑制Nrf2调控的解毒基因表达来缓解癌细胞对化疗药物的耐药性,改善化疗药物的治疗效果。基于以上背景,本研究以抗性褐飞虱种群为试验对象,试图测定实验室前期筛选出的转录抑制剂对抗性褐飞虱的增效作用,并进一步分析抑制剂对解毒基因表达水平和解毒酶活性的影响,为代谢抗性治理研发出新的问题解决方案。具体结果如下:首先通过稻苗浸渍法测定褐飞虱抗性种群和室内敏感种群对吡虫啉、毒死蜱和噻嗪酮的敏感性,与实验室前期建立的敏感基线相比,敏感种群对吡虫啉、毒死蜱和噻嗪酮的敏感性分别下降了 27倍、9.6倍和9.9倍。抗性种群对吡虫啉达到了 1188倍的极高水平抗性,对噻嗪酮有221倍高水平抗性,对毒死蜱为13倍低水平抗性。解毒酶活性测定表明,抗性褐飞虱种群的多功能氧化酶(P450)、谷胱苷肽-S-转移酶(GST)和酯酶(EST)活性分别为敏感种群的2.3倍、1.3倍与1.7倍,说明抗性种群具有显著高的解毒酶活性。进一步通过荧光定量PCR,分析了褐飞虱抗性种群和敏感种群间解毒基因的表达差异,发现在抗性种群中有4个P450基因(CYP6ER1、CYP6CW1、CYP439A1、CYP417A1v2)、4个 GST 基因(GSTs1、GSTs2、GSTz1、GSTt1)、2 个酯酶基因(EST1、CarE)和2个转录因子基因(CncC、mafK)组成型高表达。通过基因克隆得到了褐飞虱解毒酶基因CYP6ER1和CYP6A Y1的上游启动子序列,序列分析表明这2个基因的上游序列均含有转录因子CncC的结合位点。荧光报告质粒的转录活性分析表明,抗性飞虱CYP6ER1的上游序列较敏感飞虱的该基因上游序列具有显著高的荧光报告活性,说明抗性飞虱的该基因上游序列具有较高的转录活性,但抗性和敏感种群CYP6AY1上游序列的荧光报告活性没有差异。利用已构建的CYP6ER1-R1上游序列报告质粒,测定了杀虫剂吡虫啉、毒死蜱、噻嗪酮,以及索法酮和4’-羟基查尔酮对荧光报告活性的影响,发现吡虫啉与毒死蜱单独处理均可增加该报告质粒的转录活性,噻嗪酮、索法酮、4’-羟基查尔酮单独处理对荧光报告活性都没有明显影响,但当索法酮、4’-羟基查尔酮与吡虫啉或毒死蜱联合处理时,可显著地抑制这2种杀虫剂对转录活性的诱导效应,说明这2种化合物可抑制吡虫啉或毒死蜱诱导的基因表达。接下来测定了索法酮和4’-羟基查尔酮的增效作用,结果表明,索法酮和4’-羟基查尔酮能够提高褐飞虱抗性种群对吡虫啉的敏感性,对吡虫啉分别有2.6倍和2倍的增效作用,但是两种化合物对毒死蜱和噻嗪酮均无增效作用。然后测定索法酮和4’-羟基查尔酮对褐飞虱体内解毒酶活性的影响,发现吡虫啉胁迫能显著提高褐飞虱体内的P450、GST和酯酶活性,而索法酮和4’-羟基查尔酮处理却能抑制吡虫啉对这些解毒酶活性的增强效应,说明这2种化合物能解除吡虫啉胁迫所致的褐飞虱解毒酶活性升高。而通过离体酶活性测定发现索法酮和4’-羟基查尔酮对P450酶、GST和酯酶均有不同程度的抑制作用。最后进一步分析了药剂处理后褐飞虱虫体各解毒酶基因表达水平的变化。吡虫啉能够诱导褐飞虱体内9个P450基因(CYP6ER1、CYP6A Y1、CYP6CW1、CYP4CE1、CYP4DE1、CYP417A1、CYP417A1v2、CYP439A1、CYP425B1)、2 个 GST 基因(GSTm1、GSTz1)、3个转录因子(CncC、mafB、mafK)和1个酯酶基因(EST1)的表达水平升高,在与索法酮联用后,多个解毒基因(CYP6ER1、CYP6CW1、CYP41 7A1v2、CYP6AY1、CYP4DE1、CYP417A1、GSTm1、GSTz1、EST1、CncC、mafB、mafK)的表达水平相较于吡虫啉单独处理时显著降低。综上研究表明,抗性褐飞虱种群体内有多个解毒基因高水平表达,并且具较高的解毒酶活性。解毒能力提高是褐飞虱对吡虫啉等产生抗性的重要原因,同时,吡虫啉对解毒基因的表达有诱导效应,吡虫啉胁迫会使解毒酶活性增加,索法酮和4’-羟基查尔酮却能解除吡虫啉对这些解毒基因表达的诱导作用,抑制吡虫啉胁迫下解毒酶活性的升高,并表现出对吡虫啉的增效作用,这些研究成果开创了在基因转录层面控制解毒基因表达来治理代谢抗性的先河,为抗性治理开辟了新的研究方向与治理手段,对可持续的植物保护有重要的理论与实际意义。
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