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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种典型的神经退行性疾病。发病率随年龄的增加而显著增加。PD发病的确切原因难以确定,但神经炎症反应被认为在PD进展中起关键作用。近年来,核苷酸结合寡聚结合域样受体蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体在神经退行性疾病中的作用引起广泛关注。基于神经炎症和神经元损伤在PD发生发展过程中的重要作用,以及原花青素的抗氧化和抗炎作用。本研究首先用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）诱导BV2细胞,研究原花青素对LPS/ATP诱导的NLRP3炎症小体激活的影响及其相关机制。然后,采用1-甲基-4-苯基吡啶（1-Methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,探讨原花青素对MPP+诱导SH-SY5Y损伤及NLRP3炎症小体激活的影响。从炎症和神经元损伤两个方面,研究原花青素抑制炎症反应及保护神经元的作用,为PD的预防和控制提供新策略。本文主要内容分为三部分:第一部分:原花青素对LPS/ATP诱导的BV2细胞NLRP3炎症小体激活的影响研究目的:采用LPS/ATP诱导BV2细胞,探讨原花青素对LPS/ATP诱导的炎症因子分泌NLRP3炎症小体激活的影响。研究方法:（1）以LPS（0.1、1.0、10.0、20.0μg/m L）诱导BV2细胞24h,采用微板法间接测定一氧化氮（Nitric oxide,NO）含量,确定合适的浓度用于后续实验。（2）以LPS（1.0μg/m L）/ATP（1.0、2.5、5.0、10.0μmol/L）诱导BV2,LPS作用24h,各浓度ATP继续作用30min。采用四甲基偶氮唑盐（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）法检测细胞活力,分析LPS与不同浓度的ATP联合作用对细胞活力的影响。（3）设立对照组、原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）及空白组,原花青素预处理1h,LPS处理24h,ATP处理30min。采用MTT法测细胞活力,分析不同浓度原花青素、LPS+ATP+不同浓度原花青素联合作用对细胞活力的影响。（4）设立对照组、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,LPS处理24h,ATP处理30min。采用微板法间接测定细胞培养上清中NO含量;酶标法测乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）活性;酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测IL-1β和IL-18的分泌水平。（5）设立对照组、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,LPS处理6h,ATP处理30min。蛋白免疫印迹法（Western blot）测定NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1和pro-IL-1β蛋白表达水平。研究结果:（1）与对照组比较,LPS（0.1、1.0、10.0、20.0μg/m L）诱导BV2细胞NO水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,在本实验条件下LPS作用浓度与NO释放水平存在剂量-效应关系（r=0.981,P<0.001）。（2）与对照组比较,LPS（1.0μg/m L）/ATP（1.0、2.5、5.0、10.0μmol/L）组均使细胞活力下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）与对照组比较,不同浓度原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）对BV2细胞活力无明显影响,差异无统计学意义（P>0.05）。与LPS/ATP组相比,LPS/ATP+原花青素（2.5、5.0μg/m L）组细胞活力升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）与对照组比较,LPS/ATP组NO释放水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与LPS/ATP组相比,原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）各浓度干预均可降低BV2细胞NO释放水平,差异具有统计学意义（P<0.05）,且呈剂量-效应关系（r=-0.836,P<0.001）。（5）与对照组比较,LPS/ATP组LDH活性升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与LPS/ATP组相比,原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）各浓度干预均可降低BV2细胞LDH活性,差异均具有统计学意义（P<0.05）,且存在剂量-效应关系（r=-0.982,P<0.001）。（6）与对照组比较,LPS/ATP组IL-1β、IL-18释放水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与LPS/ATP组比较,原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）各浓度干预均使IL-1β、IL-18释放水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,且存在剂量-效应关系(r IL-1β=-0.906,P<0.001;r IL-18=-0.971,P<0.001)。（7）与对照组比较,LPS/ATP组NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1和pro-IL-1β蛋白表达水平均增高,差异均具有统计学意义（P<0.05）;与LPS/ATP组相比,LPS/ATP+原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平均下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;LPS/ATP+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组pro-IL-1β蛋白表达下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,LPS/ATP+原花青素（2.5、5.0μg/m L）组pro-caspase-1蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。原花青素干预浓度与NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平降低,且呈剂量-效应关系(r NLRP3=-0.818,P<0.001;r ASC=-0.960,P<0.05;rpro-caspase-1=-0.786,P<0.05;rcaspase-1=-0.742,P<0.05;rpro-IL-1β=-0.862,P<0.001)。第二部分:原花青素抑制BV2细胞NLRP3炎症小体激活的信号通路研究研究目的:用LPS/ATP诱导BV2细胞,探讨原花青素抑制LPS/ATP诱导的炎症因子分泌及NLRP3炎症小体激活的相关机制。研究方法:（1）设立对照组、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）、LPS（1.0μg/m L）/ATP（2.5μmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,LPS处理6h,ATP处理30min。Western blot法检测TLR4、MyD88表达及NF-κBp65磷酸化水平。（2）设立对照组、BAY 11-7082（5.0μmol/L）组、LPS/ATP组、LPS/ATP+BAY 11-7082（5.0μmol/L）组、LPS/ATP+原花青素（5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,LPS处理6h,ATP处理30min,Western blot法检测NLRP3,ASC,caspase-1,pro-caspase-1,pro-IL-1β蛋白表达及NF-κBp65磷酸化水平。（3）设立对照组、BAY 11-7082（5.0μmol/L）组、LPS/ATP组、LPS/ATP+BAY 11-7082（5.0μmol/L）组、LPS/ATP+原花青素（5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,LPS处理24h,ATP处理30min,ELISA法检测IL-1β、IL-18分泌水平。研究结果:（1）与对照组相比,LPS/ATP组TLR4、MyD88、p-NF-κBp65蛋白表达水平均增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与LPS/ATP组相比,LPS/ATP+原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组MyD88、p-NF-κBp65蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;LPS/ATP+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组TLR4蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,且具有剂量-效应关系(r NF-κB=-0.807,P<0.001;r TLR4=-0.851,P<0.001;r MyD88=-0.775,P<0.05)。（2）与对照组相比,BAY 11-7082组NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、p-NF-κBp65蛋白表达水平无明显改变,差异无统计学意义（P>0.05）,LPS/ATP组NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、p-NF-κBp65蛋白表达水平均升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与LPS/ATP组相比,LPS/ATP+BAY11-7082组和LPS/ATP+原花青素组NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、p-NF-κBp65蛋白表达水平均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）与对照组相比,LPS/ATP组IL-1β、IL-18分泌水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与LPS/ATP组相比,LPS/ATP+BAY11-7082（5.0μmol/L）组以及LPS/ATP+原花青素（5.0μg/m L）组IL-1β和IL-18分泌水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。第三部分:原花青素对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究目的:运用MPP+染毒SH-SY5Y,研究原花青素对SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。研究方法:（1）设立空白组、对照组、MPP+（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol/L）组,MPP+处理24h,采用MTT法检测细胞活力。设立空白组、对照组、原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素处理24h,采用MTT法检测细胞活力。设立空白组、对照组、MPP+（0.5mmol/L）组、MPP+（0.5mmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,MPP+处理24h,采用MTT法检测细胞活力。（2）设立原花青素对照组、MPP+（0.5mmol/L）组、MPP+（0.5mmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,MPP+处理24h,微量酶标法检测LDH活性;荧光探针检测ROS产生;ELISA法检测IL-1β、IL-18水平。（3）设立原花青素对照组、MPP+（0.5mmol/L）组、MPP+（0.5mmol/L）+原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组,原花青素预处理1h,MPP+处理24h Western blot法测定NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平。研究结果:（1）与对照组相比,MPP+（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mmol/L）组细胞活力下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,且存在剂量-效应关系（r=-0.926,P<0.001）。（2）与对照组相比,原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）对SH-SY5Y细胞活力无明显影响,差异无统计学意义（P>0.05）,MPP+组细胞活力下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;与MPP+组相比,MPP++原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组细胞活力增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）与对照组相比,MPP+组LDH活性升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,;与MPP+组相比,MPP++原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组LDH活性均下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,且呈剂量-效应关系（r=-0.949,P<0.001）。（4）与对照组相比,MPP+组ROS增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;与MPP+组相比,MPP++原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组的ROS水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,且存在剂量-效应关系（r=-0.949,P<0.001）。（5）与对照组相比,MPP+组的IL-1β、IL-18水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与MPP+组相比,MPP++原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组IL-1β水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,MPP++原花青素（5.0μg/m L）组IL-18水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,且呈剂量-效应关系(r IL-1β=-0.879,P<0.001;r IL-18=-0.853,P<0.001)。（6）与对照组相比,MPP+组NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1和pro-IL-1β蛋白表达水平增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;与MPP+组相比,MPP++原花青素（1.0、2.5、5.0μg/m L）组NLRP3、pro-caspase-1蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,MPP++原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0μg/m L）组pro-IL-1β表达水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,MPP++原花青素（2.5、5.0μg/m L）组caspase-1蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,且存在剂量-效应关系(r NLRP3=-0.818,P<0.001;rpro-caspase-1=-0.960,P<0.001;rcaspase-1=-0.796,P<0.001;rpro-IL-1β=-0.982,P<0.001)。研究结论:（1）LPS/ATP诱导BV2细胞炎症因子分泌水平升高及NLRP3炎症小体激活,NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平增高。原花青素抑制LPS/ATP诱导的BV2细胞炎症因子分泌和NLRP3炎症小体激活。（2）LPS/ATP诱导BV2细胞TLR4、MyD88、NF-κB信号通路激活,该通路在NLRP3炎症小体激活和炎症因子分泌中具有重要作用。原花青素通过TLR4、MyD88、NF-κB信号通路抑制LPS/ATP诱导BV2细胞炎症因子分泌和NLRP3炎症小体激活。（3）MPP+诱导SH-SY5Y炎症因子、ROS水平升高及NLRP3炎症小体激活,NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达水平增高。原花青素抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞ROS、炎症因子分泌及NLRP3炎症小体激活。