论文部分内容阅读
目的:橘皮汤是《金匮要略》中的经典方剂,由橘皮和生姜两味中药按1:2比例组成,实际应用中常以干姜代替生姜。目前橘皮汤的临床应用多以该方为基础加减以汤剂应用,市场上尚未见以该方为基础的中成药或保健食品上市,因此未能最大程度发挥该方剂的功用。另外对于该方剂的现代药理研究也有待加强。在大量前期实验研究的基础上,我们对橘皮汤（陈皮和干姜）进行二次开发,与现代制剂工艺相结合,研制出具有抗疲劳、抗氧化及改善心血管功能等多种作用的制剂-陈皮姜软胶囊。同时对陈皮和干姜的主要成分6-姜酚、橙皮苷、川陈皮素等进行药代动力学研究,阐明其体内血药浓度变化及相关药动参数,同时研究对相关代谢酶的影响及药物间相互作用。为橘皮汤的开发及其临床合理应用提供实验依据。方法:陈皮和干姜有效部位提取工艺研究:（1）陈皮挥发油提取工艺研究。根据影响挥发油提取的因素,选取浸泡时间、提取时间、加水量作为考察因素,以挥发油得率为考察指标,采用正交实验设计法筛选最佳工艺参数。（2）干姜超临界萃取工艺研究。采用单因素考察结合均匀设计法对影响超临界提取的主要因素如萃取压力、萃取温度、解析压力、解析温度等进行考察,以萃取率为指标,筛选最佳工艺条件。陈皮姜软胶囊制备及质量控制研究:陈皮姜软胶囊的制备;采用薄层色谱法建立制剂中干姜药材的鉴别方法,采用高效液相色谱法建立制剂中6-姜酚的含量测定方法。陈皮姜软胶囊体内外抗氧化功能实验研究:采用紫外分光光度法,测定不同浓度的供试品对1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）清除能力,评价其体外抗氧化效果;将老龄小鼠按丙二醛（MDA）水平分为老龄对照组和低、中、高三个剂量组。连续灌胃15、30天后,分别测定血清MDA含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力。采用高效液相色谱法测定陈皮（橙皮苷和川陈皮素）和干姜（6-姜酚）主要成分在大鼠体内的血药浓度,并研究其药物动力学。橙皮苷、川陈皮素和6-姜酚间的药物相互作用研究:使用人肝微粒体（HLM,混合组分）和特异性抑制剂对橙皮苷、川陈皮素、6姜酚的一相转化途径进行考察,推断何种代谢酶参与了转化途径;使用人肝微粒体和探针底物考察橙皮苷、川陈皮素、6-姜酚对各细胞色素氧化酶（CYP）的抑制作用。结果:陈皮挥发油最佳提取工艺条件为:浸泡时间2小时、提取时间10小时、加水量10倍量;干姜超临界精油最佳萃取工艺条件为:药材粒度30目,萃取压力28Mpa,萃取温度48℃,解析Ⅰ压力6Mpa,解析温度Ⅰ 35℃,解析Ⅱ压力6Mpa,解析温度Ⅱ 30℃,萃取时间3h。陈皮姜软胶囊的研制:根据药典中药材的最大用量及有效部位的最佳配比,按照压制0.4g/粒软胶囊的要求,确定辅料大豆油的用量,将原辅料混合均匀后,压制了 1万粒陈皮姜软胶囊;成品中干姜药材鉴别的供试品色谱中,在与干姜对照药材和6-姜酚对照品色谱相应的位置上显相同斑点;根据高效液相色谱法测定成品中6-姜酚的含量为 3.58%（14.31mg/粒）。陈皮姜软胶囊体外抗氧化实验显示,其对DPPH的半数清除率IC50为0.55mg/mL;体内实验老龄小鼠给药15天后中、高剂量组对MDA含量与对照组比较明显降低,SOD和GSH-PX活性明显升高,低剂量给药组的抗氧化作用不明显;给药30天后各剂量组对MDA含量与对照组比较明显降低,SOD和GSH-PX活性明显升高,抗氧化作用明显。建立了高效液相色谱法测定大鼠血浆中橙皮苷、川陈皮素和6-姜酚的方法,方法学考察均符合生物样品分析的要求。橙皮苷、川陈皮素和6-姜酚的半衰期t1/2（β）值分别是 11.55±2.11,15.07±2.94,15.40±2.14;最大浓度 Cmax 值是:1.88±0.37,2.55±0.42,0.98±0.26;药时曲线下面积（AUC）0→∞值是:16.59±2.20,16.90±3.91,3.56±0.96。橙皮苷在人肝微粒体反应体系中孵育时没有表现出明显的代谢趋势,表明橙皮苷在人体内的代谢不是由CYP或黄素单加氧酶（FMO）等需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）辅酶的代谢酶介导。而川陈皮素和6-姜酚则在肝微粒体反应体系中显示能很快被代谢。川陈皮素对CYP1A2有较强的抑制作用(IC50=3.1μM),而6-姜酚对CYP2C19有较强抑制(IC50=9.9μM)。此外,川陈皮素对CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19有一定的抑制作用,而6-姜酚对CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4有一定的抑制作用。川陈皮素对6-姜酚的代谢有明显的抑制作用,而且该抑制作用为时间依赖性抑制（TDI）,高浓度（10μM）时可增加6-姜酚在人肝微粒体反应体系中孵育30分钟后的剩余率6.4倍（从剩余14%到剩余93%）,在低浓度（1μM）时,也可增加2.6倍（从剩余14%到剩余38%）。橙皮苷对6-姜酚的代谢及橙皮苷和6-姜酚对川陈皮素的代谢则影响不大。结论:本文所建立的干姜超临界提取和陈皮挥发油提取的最佳工艺参数,经中试放大实验验证,重现性良好,表明最佳工艺条件稳定可行。压制的陈皮姜软胶囊各项制剂指标均符合要求,所建立的薄层鉴别及含量测定方法准确、可靠、简便,专属性强,可有效控制产品的质量。本文中陈皮姜软胶囊体外抗氧化实验结果表明,其抗氧化效果较强。体内实验显示其可以明显降低老龄大鼠MDA含量,对SOD和GSH-PX活性均显著上升。本文所研究陈皮和干姜药材中的主要成分橙皮苷、川陈皮素和6-姜酚对代谢酶的抑制作用及互相之间的代谢相互作用研究,发现川陈皮素对6-姜酚的代谢有明显的抑制作用,由于川陈皮素对1A2有较强的抑制用,推测6-姜酚的I相代谢主要通过CYP1A2介导,所以对1A2有强抑制的川陈皮素和6-姜酚联合使用时,因为抑制CYP1A2代谢途径,对6-姜酚起到减少体内清除,增加功效的作用。