研究背景:血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)主要是由血管内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞终足构成的一道扩散屏障,几乎存在于整个脑组织。脑毛细血管内皮细胞与身体其他部位内皮细胞不同,细胞之间没有孔隙,取而代之的是细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)。脑毛细血管内皮细胞缺乏囊泡胞饮系统[1],但含有丰富的酶系统,可以分解各种药物及营养物质,构成了一道酶屏障[2]。正是由于脑内毛细血管内皮细胞这些特殊结构使得BBB能在保护脑组织不受外界伤害性刺激影响的同时也将许多治疗性药物拒之门外[3]。因此近几年开发了很多增加BBB通透性的方法来帮助药物、抗体、基因成功地透过BBB进入脑组织。有体外实验研究证实超声能够用来打开血-组织屏障,使大分子和基因能够穿过细胞质膜[4]。此外高强度聚焦超声也可以用于选择性的开放大鼠BBB。在超声照射前给予一定量微泡造影剂,因为超声空化核的引入可以降低超声开放BBB时所需要的超声能量,从而可以减少组织损害的风险并使该技术能够通过完整的颅骨实施BBB能够可逆性的开放BBB而不引起神经细胞的急性损伤。而目前尚无诊断超声联合超声造影剂SonoVue开放血脑屏障的报道。因此本实验就将就这一空白进行研究,并进一步探讨SonoVue介导UC开放BBB的安全性。目的首先验证超声造影剂声诺维(SonoVue)介导诊断超声(diagnostic ultrasound,DU)增加大鼠BBB通透性的可行性与可逆性,同时进行动脉血气分析检测该方法是否会对大鼠循环系统产生影响。随后使用组织学染色来观察本实验条件的超声造影(ultrasonic contrast,UC)是否会造成大鼠神经细胞的坏死及红细胞的渗出。最后通过Morris水迷宫实验(Morris water maze, MWM)来检测大鼠学习记忆功能进一步评估本实验开放BBB方法的安全性。方法实验一、SonoVue介导DU开放大鼠BBB可行性和可逆性研究以及对大鼠动脉血气的影响1.SonoVue介导DU开放大鼠BBB可行性根据处理方法的不同将32只大鼠随即分为四组,每组8只:Con组大鼠仅进行麻醉、备皮、静脉置管,而不进行其他操作直接给予伊文思蓝(Evens blue,EB);单纯超声组动物进行麻醉、备皮、静脉置管后给予生理盐水,然后进行超声10min,并同时注射EB;单纯造影剂组大鼠在麻醉、备皮、静脉置管后直接给予SonoVue,10min后静脉注射EB;UC组大鼠在进行麻醉、备皮、静脉置管后,静脉注射SonoVue同时开始UC10min,超声结束即刻给予EB。2.SonoVue介导DU开放大鼠BBB的可逆性为确定BBB开放是否可逆,根据时间不同又将实验动物随机分为4组:2h、4h、6h、8h组,分别于UC后的2h、4h、6h、8h注射EB检测当时BBB开放情况,每组SD大鼠8只。3.SonoVue介导DU开放BBB对大鼠动脉血气的影响随机抽取8只进行UC的大鼠,每只大鼠分别于UC前、UC5min、UC后即刻抽取动脉血1ml检测其动脉血PO2、PCO2、PH等指标。实验二SonoVue介导DU开放BBB对大鼠脑组织神经细胞的影响三只雄性SD大鼠经UC开放BBB后取脑切片进行HE染色,在显微镜下观察神经细胞是否有坏死及是否有红细胞渗出。实验三SonoVue介导DU开放BBB对大鼠学习记忆功能的影响实验动物随机分为三组,每组8只大鼠:Con组,该组大鼠不做任何处理直接进行MMW;假手术组,该组大鼠仅进行麻醉、备皮、静脉置管,而不给予UC,并于麻醉后24h开始进行MWM实验;UC组:该组大鼠进行麻醉、备皮、静脉置管、给予UC,并于超声后24h开始进行MWM实验。结果1. SonoVue可以介导DU局灶性的开放大鼠BBB,主要表现在超声辐照区局部EB渗出;且这一通透性的改变是可逆的,BBB的开放可以持续4h。2.大剂量SonoVue不会影响大鼠动脉血气的变化。3.本实验参数不会对超声辐照区域大鼠神经细胞产生损害,不会造成脑血管内皮细胞损害使红细胞渗出。4.通过对大鼠进行MWM实验可观察到UC开放BBB后的大鼠在定位航行实验中与Con组和Sham组相比逃逸潜伏期缩短,上台前距离缩短;在最后一天空间探索实验中的目标象限停留时间延长。证明UC开放BBB后的大鼠其空间学习与记忆能力都有所提高。结论本实验首先通过EB渗透法证明超声造影剂声诺维介导诊断超声可以局部开放大鼠BBB,且BBB通透性的增加可以持续4h。同时使用脑组织HE染色来观察超声造影不会造成大鼠神经细胞的坏死也不会造成超声照射区红细胞的渗出。MWM实验证明大鼠在超声造影后空间学习记忆功能都有所提高。因此我们可以得出本实验所使用的UC参数可以靶向性、可逆性开放BBB且不会对CNS结构和功能以及大鼠动脉血气造成不良影响。