目的探讨铜绿假单胞菌PAO1中GGDEF-EAL结构域蛋白质PA0861的生物学功能,并分析环二鸟苷酸(C-di-GMP)与铜绿假单胞菌铁的吸收之间的关系,以期在未来加深对铜绿假单胞菌致慢性感染的相关原因的理解。方法从Manoil实验室得到了PA0861转座子突变体菌株和PAO1野生型菌株。首先采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction PCR)方法来确认基因PA0861的突变位点。之后经表型分析,比较突变体及野生型铜绿假单胞菌生物膜的变化。利用Microarray比较PA0861突变体菌株和PAO1野生型菌株的基因表达谱。Microarray数据首先通过GO分析基因表达的相关数据,运用WEGO对突变体PA0861和野生型PAO1中表达不同的基因进行对比分析。然后运用KEGG和DAVID对PA0861可能影响的信号转导通路进行分析,比较铜绿假单胞菌中铁载体合成的一系列基因,利用半定量逆转录聚合酶链反应分析PA0861对调控铁载体合成的影响,比色法和薄层层析色谱在基因产物的水平来验证两个菌株铁载体水平,从而初步分析基因PA0861是如何影响铜绿假单胞菌铁的吸收,以及推断c-di-GMP来调节铜绿假单胞菌铁载体的生物学作用。结果1.通过PCR反应结果经琼脂糖凝胶电泳得到的结果来看,A2与C2得到了明亮清晰的条带,A2与C2的模板都是突变体PA0861,而其它样品没有条带,从而可以得出由于转座子的插入位点在PA0861基因上,从而导致其失活。2.对菌株突变体PA0861和野生型PAO1进行表型对比分析,通过结晶紫染色生物膜定量实验,在LB液体培养基中生长4、8、12小时的两个菌株,统计得出突变体PA0861形成的生物膜在各个时间点都比野生型PAO1生成的多,均有统计学意义(P<0.05)。3.Microarray分析铜绿假单胞菌整个基因表达谱,分析以后发现在突变体PA0861和野生型PAO1的比较中有2782个基因在转录水平上发生改变,其中大约有2400个基因m RNA上调382个基因下调达两倍以上。由于上调的基因比下调基因多很多,我们校正标准,选择的标准为PA0861上调达到6倍和下调达到2.5倍才计为差异表达。FDR<5%,SAM在0.05(P<0.05)。结果分析导致上调的基因是319个,下调的基因为198个。1)通过GO分析全面比较在突变体PA0861和野生型PAO1中表达谱,初步发现在这517个发生变化的转录子中,显著性不同的有215个,占了调节铜绿假单胞菌的生物学过程42%。2)利用WEGO分析突变体PA0861的生物学功能的时候,发现涉及到色素的基因有26个。3)利用KEGG进行通路分析,在P<0.05的情况下,除了涉及到核酸合成,细胞周期,能量产生等以外,最突出的在突变体PA0861中,铁载体生物合成的基因,有5个基因被激活。4.铜绿假单胞菌中有两个主要的铁载体,假单胞菌素(Pyoverdine)和铜绿假单胞菌螯铁蛋白(Pyochelin)。利用KEGG通路分析时,发现最突出的是突变体PA0861中五个与铁载体生物合成的基因被激活。调控Pyoverdine合成的基因位于PAO1基因组,横跨约120kb的区段,约70个基因。我们从中挑选了11个基因,分别代表上调2倍到19倍,然后通过以GAPDH为内参,用半定量RT-PCR的方法进行m RNA水平的比较,结果是PA2385,PA2392,PA2394,PA2395,PA2398,PA2403,PA2443,Pvd S的表达是上调,PA2388和PA2418是下调,PA2444在突变体PA0861和野生型PAO1中没有变化。对于Pyochelin,在突变体PA0861中,所有基因都上调,倍数在3.86-14倍之间。总体上大多数基因是上调的,只有少数减少和没变化。5.进一步对Pyochelin运用TLC的方法进行半定量的比较分析,以水杨酸为标准品,并以具有PDE活性的Roc R,有DGC活性的Wsp R作对照。从结果可以看出突变体PA0861生成的Pyochelin比PAO1生成的多,与ROCR突变体合成的相近。6.通过对菌株突变株PA0861和野生型PAO1中Pyoverdine,用比色法作定量分析,得到在6小时和18小时,突变体PA0861中Pyoverdine的产量都比野生型PAO1的多,均有统计学意义(P<0.05)。说明基因PA0861可能调控铁载体的生物合成,从而也调控铜绿假单胞菌生物膜的合成。结论我们已经知道PA0861基因涉及c-di-GMP的合成与分解,并影响生物膜的形成。为了进一步了解PA0861基因是通过怎样的分子机制来影响生物膜,首先通过在转录的水平上对其进行分析,发现基因PA0861的失活使涉及铁载体Pyoverdine和Pyochelin合成的基因绝大多数发生了上调,说明基因PA0861可能影响对铜绿假单胞菌的铁载体形成,由此影响了生物膜的形成,其趋势与我们先前对基因PA0861进行生物学表型分析的结果一致。由此的初步结论是基因PA0861调节铜绿假单胞菌对铁的吸收,为进一步理解c-di-GMP在铜绿假单胞菌中的生物学功能提供一些启示。