CIP2A(Cancerous inhibitor of protein phosphatase2A)是蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A，PP2A)的癌性抑制因子，又名KIAA1524或p90，是最近被鉴别出的一种人类癌蛋白。多项研究表明CIP2A在正常组织中不表达或低表达而在多种恶性肿瘤中呈高表达，细胞实验也证实CIP2A与细胞恶性表型及恶性行为密切相关。提示我们CIP2A参与到肿瘤的发生发展过程，但是机制尚不清楚。　　骨肉瘤是一种青少年和儿童的常见恶性肿瘤，约占原发骨肿瘤的20％，同时占小儿恶性肿瘤的2.4％。骨肉转移的瘤患者的生存率在过去的30年并没有提高。约有40％的患者因骨肉瘤导致预后不良。因此，研究骨肉瘤的增殖，侵袭和转移的分子机制可为骨肉瘤患者治疗巨大的好处。越来越多的证据表明CIP2A是一种能够促进细胞增殖和细胞侵袭的肿瘤蛋白。然而，CIP2A在骨肉瘤组织中的表达模式以及其对于骨肉瘤细胞侵袭能力的调控作用尚不明确的。　　材料和方法：　　1、组织来源　　51例原发性骨肉瘤病组织，来自于2005年到2012年在中国医科大学附属第一医院实行手术切除，并经病理诊断和分型后的存档蜡块，组织经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋。蜡块组织的使用获得了伦理委员会的同意和许可。所有患者在术前均未接受过放化疗。根据Enneking评分系统，将标本分为高度恶性的局限型骨性肉瘤(ⅡA)，侵袭性骨肉瘤(ⅡB)。　　2、免疫组织化学染色　　多克隆抗体CIP2A（1∶200稀释;Novus生物制剂），采用Elivision试剂盒(MaiXin，China)，以PBS代替一抗作为空白对照。选肿瘤细胞阳性染色集中区域，每张切片计数400个癌细胞，由两名病理医师双盲观测。结果判定: CIP2A免疫组化阳性信号主要定位于细胞浆，也有少量核表达，表达百分率分为以下4个等级:1-25％为1分，26-50％记为2分，51-75％记为3分，76-100％记为4分。根据免疫组化染色强度分为3个等级:无着色或仅微弱着色记为0分，淡黄色颗粒着色记为中度1分，棕褐色颗粒强着色记为2分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分:＜4为阴性;≥4为阳性。　　3、细胞培养与siRNA转染　　MG-63细胞系购自ATCC(Manassas，VA，USA)，用含10％热灭活新鲜小牛血清MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素(Sigma, St.Louis，MO，USA)的培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养。　　CIP2A特异性siRNA和对照乱序siRNA购自Dharmacon(Dharmacon，Lafayette，CO，USA)。siRNA转染试剂为DharmaFECT1(Dharmacon，Lafayette，CO，USA)。60小时后应用Western blot检测转染效率。　　4、Western blot检测　　收集培养细胞，加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，12000转/min，30min)，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60ug。电泳（12％SDS-PAGE凝胶）、转印(50V,120min)、5％正常小牛血清封闭，抗CIP2A(1∶1000; Novus), c-Myc，phospho-AKT, AKT(1∶1000, Cell Signaling Technology, USA)和β-actin(1∶1500;BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ，USA)，4℃孵育过夜，分别与对应的二抗(1∶2500，santa cruz，USA)室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪(Chemi Imager5500，Alpha Innotech，USA)采集，进行灰度值测定。　　5、RT-PCR分析　　转染CIP2A24小时后收集细胞，使用trizols试剂提取RNA，采用ABI highcapacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)进行反转录。使用SYBR Green PCRmaster mix(Applied Biosystems)进行定量real-time PCR扩增，总体积20μl。使用7900HT实时定量PCR仪过程如下:95℃，30秒;95℃，5秒，40个循环;60℃，30秒。检测CIP2A和MMP9的表达情况，内参采用beta actin。基因相对表达水平计算方式如下△Ct=Ct gene-Ct reference，增加倍数用如2-△△Ct方法计算，每次试验均做三个重复孔。 CIP2A forward,5-ATACTTCAGGACCCACGTTTGAT-3，CIP2A reverse,5-TCTCCAAGTACTAAAGCAGGAAAATCT-3，MMP9 forward,5-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3;MMP9 reverse,5-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3;β-actin forward,5-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3，β-actin reverse,5-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3.　　6、细胞侵袭能力检测　　用预冷无血清MEM培养基以1∶5稀释Matrigel(BD Biosciences，USA)，将转染后24小时后的细胞制成细胞悬液，调至细胞密度为2.5×10个/ml，取100μl加入上室（孔径8um，Costar，USA），下室加600μl含10％小牛血清MEM培养基。37℃、5％ CO2孵箱中培养18小时后吸尽培养基，PBS清洗后，甲醇室温固定15min，用棉签轻擦掉上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。取下微孔膜，至载玻片上，镜下计数细胞数，实验重复3次，取均值。　　7、细胞凋亡检测　　运用AnnexinⅤ-FITC/PI双染试剂盒，收集细胞后经冷PSB冲洗后使用结合缓冲液悬浮，并调整细胞密度值2-5×105/ml，于暗室中在195ul体系中加入5μlAnnexinⅤ-FITC室温孵育10分钟后加入190μl结合缓冲液(1×)和10μl PI。使用FACScan流式细胞仪进行检测并使用CellQuest分析软件分析数据。　　8、CKK-8法检测细胞增殖及集落形成实验　　将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积200ul含103个细胞，培养24小时，每孔加入CKK-8溶液10ul继续培养1小时，振荡10min，450nm波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。集落形成实验在转染48小时后接种1000个细胞于6cm培养皿中2周后用Giemsa染色并计数。　　9、数据分析　　采用SPSS10.0统计分析软件，对CIP2A过表达和MMP9过表达的关系用卡方检验;其他实验结果采用t检验进行数据分析，用mean±SD表示， P＜0.05为差异有意义。　　结果：　　1、CIP2A蛋白在骨肉瘤中的表达隋况　　我们实用免疫组化方法检测了正常骨组织和骨肉瘤中CIP2A的表达情况。结果显示CIP2A的阳性表达主要为细胞浆也有少量核表达。在正常骨组织和软骨组织中，CIP2A染色呈阴性。而在51例骨肉瘤组织中有39例为CIP2A阳性表达，阳性率为76.5％。接着，我们分析了CIP2A蛋白表达与临床病理因素之间的关系，发现CIP2A的表达与年龄、性别、组织学类型和分期没有明显关系。虽然我们统计结果显示CIP2A在晚期骨肉瘤的阳性表达率（ⅡB期骨肉瘤:80.5％）比在早期骨肉瘤（ⅡA期:66.6％）阳性表达率更高，但是二者差异无统计学意义。　　2、干扰CIP2A可以抑制细胞的增殖　　文献报道称CIP2A可以促进肿瘤细胞的增殖能力，但其在骨肉瘤细胞中的生物学功能的研究尚不清楚。为了研究CIP2A对骨肉瘤细胞增殖能力的影响，我们对MG-63细胞进行CIP2A siRNA干扰，48小时后实用MTT和集落形成实验检测细胞的增殖能力。Western blot和Real-time PCR结果显示干扰CIP2A后，MG-63细胞的CIP2A的蛋白和RNA水平均下降。应用集落形成法检测CIP2A在细胞增殖中的作用，实验结果显示与对照组相比，CIP2A缺失的肿瘤细胞其数量及大小呈显着降低(control vs sRNAi:336±21 vs167±15，p＜0.05)。此外，CCK-8增殖实验结果表明抑制CIP2A可以明显降低细胞的增殖速度。　　3、CIP2A通过调节p-AKT、c-myc的表达影响细胞的增殖　　最近的研究证明，c-Myc和p-Akt作为CIP2A-PP2A通路的下游靶蛋白也受其调控。众所周知，有丝分裂时，c-myc蛋白是一种调控细胞增殖和分化的调控蛋白，它可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，激活那些与细胞的增殖和分化有关的基因。为了进一步揭示CIP2A促进细胞增殖的潜在机制，我们在骨肉瘤细胞中进行了CIP2A敲出，western blot结果显示，抑制CIP2A的表达可以明显降低c-myc和P-Akt的蛋白水平。上述结果表明CIP2A可能通过调节c-myc和Ak而促进恶性肿瘤的发生发展。　　4、干扰CIP2A可以促进细胞的凋亡　　细胞凋亡是重要的细胞程序性死亡形式，肿瘤细胞往往可以逃脱细胞凋亡而达到永生。因此，我们在MG-63细胞系中转染CIP2A特异性siRNA，运用western blot和real-timePCR法在蛋白和RNA水平检测了干扰效率。运用AnnexinⅤ/PI检测手段，AnnexinⅤ检测凋亡细胞而PI检测死细胞，流式细胞仪检测结果显示抑制CIP2A明显促进肿瘤细胞的凋亡。提示CIP2A促进骨肉瘤细胞的恶性行为。　　5、干扰CIP2A抑制细胞的侵袭　　细胞侵袭能力与肿瘤恶性行为密切相关。我们应用Transwell基质胶实验来检测CIP2A对细胞侵袭性的影响。结果显示与对照组比较，抑制CIP2A可以显著抑制细胞的侵袭能力(control vs sRNAi:137±9 vs79±5，p＜0.05)。Real-time PCR结果显示干扰CIP2A可以抑制基质金属蛋白酶mmp-9的表达。已知mmp-9是重要的侵袭相关因子，能够降解细胞外基质进而促进细胞的侵袭能力。我们的实验结果与之前CIP2A相关研究报道结果一致，CIP2A作为促癌因子调节细胞的增殖，凋亡，侵袭等恶性生物学行为。　　结论：　　1、CIP2A在骨肉瘤中存在过表达。　　2、干扰CIP2A抑制细胞的增殖和侵袭。　　3、干扰CIP2A促进细胞的凋亡。　　4、CIP2A调节C-MYC/AKT进而影响细胞的增殖和侵袭。