循环肿瘤细胞被认为与恶性肿瘤的复发、转移密切相关,因其对肿瘤的早期断、临床分期、复发转移和耐药监测、预后判断、开发新的治疗靶点具有重要值,近年来受到研究者的广泛重视。由于循环肿瘤细胞检测创伤小,简便易行,便于动态监测,该检测技术常被称为“液体活检”。目前已经有多种富集、分选循环肿瘤细胞(CTCs)的方法相继出现。循环肿瘤细胞的捕获、计数及下游分析也已应用于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌等研究中。胆道肿瘤包括胆囊癌和胆管癌,是一类侵袭性强、恶性度高的疾病,因其在临床上诊断、治疗困难,预后差,严重威胁着人们的生命健康。然而,目前国内尚无对胆道肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞的系统性研究。目前,人们对循环肿瘤细胞的研究除了聚焦于计数与临床分期、预后的相关以外,还试图通过体外获取单个循环肿瘤细胞基因组及扩增技术,为实现下游系列分子水平研究做准备,诸如：数字PCR、基因组测序等。本研究中对该术平台的开发和应用,为稳定获得循环肿瘤细胞单细胞基因组及其扩增产物,从而进行临床耐药相关位点分析、开展疾病转归动态监测、研究肿瘤侵袭转移过程相关分子变化肿瘤的异质性研究提供了前提。方法：1、选取临床样本,根据预设的纳入标准和排除标准选择入组病人,根据手术情况(是否行根治性切除)及术后病理决定循环肿瘤细胞检测的次数和时间点,并制定随访方案。2、征得患者或其家属知情同意后,利用GILUPI公司研制的循环肿瘤细胞探针从外周血(肘静脉)捕获循环肿瘤细胞。3、经过对GILUPI探针上捕获细胞的洗涤、固定、穿孔、封闭步骤后,利用多种荧光直标的单克隆抗体,包括：上皮细胞粘附分子抗体,细胞角蛋白抗体,CD45,以及Hoechst 33342对探针上粘附的细胞进行染色。4、在荧光显微镜下利用不同滤光片通道对探针上的细胞进行观察、拍照、鉴定,对符合标准鉴定为循环肿瘤细胞的细胞进行计数。5、统计分析循环肿瘤细胞计数与患者肿瘤分期、分型、疾病进展与预后之间的关系,探讨计数结果的临床意义与价值。6、探索多种富集、分离循环肿瘤细胞后体外基因组获取扩增技术,包括显微切割、单细胞毛细玻璃纤维管显微操作、DEPArray非均匀电场细胞操作系统等。结果：1、胆道恶性肿瘤组织中上皮细胞粘附分子多为高度-中度表达。2、通过将GILUPI探针置入肘部静脉30分钟,能够捕获到部分胆道恶性肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞,并实现对附着于探针上的细胞的免疫荧光染色鉴定和计数。并且这一临床操作基本安全,本研究中未出现并发症和不良反应。3、将检测临界值设定为2：以检测到的外周血循环肿瘤细胞数大于或等于2个定义为阳性,小于2个为阴性。在此设定下,胆道恶性肿瘤患者循环肿瘤细胞阳性率为52.5%,计数结果为2.95±3.78；胆道良性疾病患者循环肿瘤细胞阳性率为11%,计数结果为0.56±1.33个4、胆道恶性肿瘤患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期循环肿瘤细胞计数分别为：1.30±1.57个2.00±2.88个,6.38±4.60个,12个；检出率分别为40%,43%,88%,1/1.5、91%的胆道恶性肿瘤患者在行根治性切除手术后,复查外周血循环肿瘤细胞计数较术前检测值下降。5、循环肿瘤细胞检测对肝胆恶性肿瘤区别于良性疾病的阳性预测值为95.5%.7、密度梯度离心法、带孔滤膜加压过滤-截留法,利用毛细玻璃纤维管显微操作技术、显微切割红外粘取技术、非均匀电场单细胞操作技术在对循环肿瘤细胞的富集分离和单细胞精细操作方面各有特点,能满足不同类型的实验需求。根据实验需求综合运用各种技术平台,可以实现对循环肿瘤细胞的高通量、精准、便捷、无损操作8、利用REPLI-g Single Cell Kit可以实现对单个循环肿瘤细胞基因组的获取和扩增。结论：1、相比于良性疾病患者,胆道恶性肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞检测的阳性率明显升高,计数结果也较多,两组病人之间上述两个指标均有统计学差异。2、胆道恶性肿瘤分期与外周血循环肿瘤细胞计数呈现正相关性。3、循环肿瘤细胞检测在对病程动态检测中可以发挥重要作用。4、对于胆囊占位性病变,术前检测循环肿瘤细胞可能有助于对胆囊黄色肉芽肿性炎和胆囊癌的鉴别。5、根据实验需求综合运用各种技术平台,可以实现对循环肿瘤细胞高通量、精准、便捷、无损的富集和单细胞操作,以及基因组的体外获取和扩增。