TRIM32(Tripartite motif protein 32,TRIM32)是RBCC-NHL型TRIM家族分子,即N端含有RING,B-box和Coiled-coil结构域,C端含有6个NHL重复结构域。TRIM32在哺乳动物细胞中普遍表达,参与多种细胞生理过程,包括天然免疫,发育和分化,信号传导和癌症的演变进程等。在天然免疫方面,TRIM32可通过泛素化XIAP、PIASy和STING等参与多个天然免疫信号通路的调节。此外,TRIM32还通过泛素化流感病毒RNA聚合酶复合物催化核心PB1、结合鼠伤寒沙门氏菌分泌的效应物Ssek3等在病原-宿主相互作用中发挥重要作用。但是,TRIM32在革兰氏阳性菌感染过程中的功能和机制尚未有研究报道。本研究以猪链球菌和单核细胞增生李斯特菌为模式细菌,分别研究TRIM32在胞外菌和胞内菌感染过程中对天然免疫的调节及作用机制。猪链球菌是人畜共患病原菌,感染会导致宿主中毒性休克综合征和脑膜炎;单核细胞增生李斯特菌是食源性病原菌,在免疫低下人群和胎儿中尤其易感,发病严重会导致菌血症和脏器衰竭,治疗不当会引起胎儿致死。既往研究发现,猪链球菌感染早期造成炎症因子风暴,造成急性死亡,后期通过细胞旁方式穿过血脑屏障,造成脑膜炎。单核细胞增生李斯特菌主要通过自身双链DNA和分泌的c-di-AMP激活宿主先天免疫识别系统,通过NF-κB、MAPK、STAT等信号通路,激活宿主干扰素和炎症因子产生,加重宿主炎症感染。在本研究第一部分,我们通过TALEN和CRISPR/Cas9技术,分别构建了TRIM32基因缺失小鼠和RAW264.7细胞系,为研究TRIM32在革兰氏阳性菌感染过程中的功能和机制提供了研究材料。在本研究第二部分,我们研究了TRIM32在猪链球菌中毒性休克综合征和脑膜炎中的作用。我们用大剂量猪链球菌05ZYH33通过腹腔和静脉注射方式感染野生型和TRIM32基因敲除小鼠,研究TRIM32缺失对细菌感染后小鼠存活、菌血症水平以及血中细胞因子和趋化因子含量的影响。研究发现:相比于野生型小鼠,TRIM32基因缺失小鼠在猪链球菌感染后存活率提高,血中细菌载荷显著降低,促炎症细胞因子(IL-6,TNFα,IL-18,IL-1β,IFN-γ)和趋化因子(MCP-1,MCP-3,GROα,MIP-1β,MIP-2,IP-10,RANTES)显著降低。上述结果提示:TRIM32在猪链球菌感染过程中正调控天然免疫信号通路。我们用低剂量猪链球菌05ZYH33腹腔感染野生型和TRIM32基因敲除小鼠构建猪链球菌脑膜炎模型,研究感染不同时间后脑中细菌载荷,病理损伤情况,血脑屏障通透性改变情况以及血液和脑中天然免疫细胞的组成和数目变化情况。研究发现:相比于野生型小鼠,TRIM32基因敲除小鼠脑中细菌载荷显著降低,脑膜炎症状显著下降,提示TRIM32缺失减轻猪链球菌脑膜炎的发生。后继的研究发现相比于野生型小鼠,TRIM32基因敲除小鼠在猪链球菌感染早期,增大血脑屏障通透性,增加炎性单核细胞和中性粒细胞的脑实质浸润,有助于清除脑中细菌,降低脑中细菌载荷,从而阻止或减轻猪链球菌脑膜炎的发生。在本研究第三部分,我们利用单核细胞增生李斯特菌感染模型,研究了TRIM32在胞内菌中感染中的功能。我们首先发现TRIM32在单增李斯特菌感染过程中上调表达,提示TRIM32可能参与细菌的感染过程。在小鼠感染模型中,我们发现相比于野生型小鼠,TRIM32基因缺失小鼠存活率显著提高,脾脏和肝脏中细菌载荷和病理损伤显著下降,血清中炎症因子(IL-12、IL-18、IL-6和TNFα)和干扰素IFN-γ、IFN-β显著下调,p44/42、p-JNK、STAT1和TBK1磷酸化水平减弱。上述结果提示,TRIM32正调控单增李斯特菌感染激活的天然免疫通路。随后,我们进一步研究了TRIM32缺失降低单增李斯特菌感染造成损伤的机制。首先,我们通过流式细胞术研究单增李斯特菌感染后天然免疫细胞亚群的动态变化,发现相比于野生型小鼠,TRIM32基因敲除小鼠在在感染第一天增加脾脏中巨噬细胞的比例,在感染第三天显著提高肝脏中性粒细胞的比例,提示TRIM32缺失有助于增加吞噬细胞清除细菌。通过进一步研究脏器中天然免疫细胞亚群的活性和杀菌能力,我们发现TRIM32缺失提高脾脏中存活中性粒细胞的比例,且增加中性粒细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的能力。此外,TRIM32缺失显著提高脾脏中自然杀伤细胞产生IFN-γ和TNFα的能力以及巨噬细胞分泌IL-12和i NOS的含量。最后,我们发现TRIM32缺失显著降低单增李斯特菌在巨噬细胞中的存活。上述结果提示:在单增李斯特菌感染过程中,TRIM32通过多种机制降低天然免疫细胞清除细菌的能力。综上所述,我们研究发现TRIM32在革兰氏细菌感染过程中正调控天然免疫信号通路,并通过多种机制降低天然免疫细胞对细菌的清除。我们认为作为宿主抗菌天然免疫信号通路中的关键分子,TRIM32有望成为潜在的抗菌治疗药物靶标。