论文部分内容阅读
目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是老年人最常见的痴呆类型之一,主要病理特征是神经系统中的中枢神经逐渐丧失功能,临床表现为记忆力逐步减退,认知能力逐渐丧失以及行为改变,最终导致残疾和死亡,其发病机制不明。目前还没有治疗AD的有效药物和方法。ZCY-15是参照美金刚及其酰胺类似物结构设计并合成的新型化合物,可以很好地改善喹啉酸诱导小鼠痴呆模型的认知和学习能力,药效略优于美金刚。本课题通过对ZCY-15的药代动力学、组织分布、代谢、排泄方面进行系统性研究,阐明其体内过程,为ZCY-15的开发和利用提供了药代动力学支持;通过药效学研究考察ZCY-15对AD细胞和小鼠模型的神经保护作用,探究ZCY-15的主要药物靶点及作用通路等,明确抗AD药效,为后续研究提供药效学基础。研究方法:1.药代动力学和组织分布研究建立LC-MS/MS法测定大鼠血浆中ZCY-15浓度的定量分析方法,并对方法的专属性、基质效应、回收率、准确度和精密度、稳定性等方面进行验证;在低、中、高(0.75、2.25、6.75 mg·kg-1)剂量灌胃和中剂量(2.25 mg·kg-1)尾静脉注射给药后,测定大鼠体内ZCY-15的血药浓度,分析其药动学行为和吸收特征。建立LC-MS/MS法测定大鼠组织器官中ZCY-15浓度的定量分析方法,并对方法的专属性、基质效应、回收率、准确度和精密度、稳定性等方面进行验证;中剂量(2.25 mg·kg-1)灌胃和尾静脉注射给药后,测定不同时间点脑、海马、肝、心、脾、肺、肾、脂肪、肌肉、睾丸（雄）或卵巢（雌）、大肠、小肠、胃中ZCY-15浓度,探究其在大鼠组织器官中分布及随着时间变化的情况,明确其血脑屏障通过性,能否到达脑内预定组织。2.代谢和排泄研究应用高分辨质谱Bruker TM Tims TOF Pro串联Bruker TMELUTE UPLC,对中剂量(2.25 mg·kg-1)灌胃给药后大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便中ZCY-15代谢产物进行鉴定,明确代谢物的化学结构、代谢时间和代谢途径特征等。建立LC-MS/MS法测定大鼠排泄物中ZCY-15浓度的定量分析方法,并对方法的专属性、基质效应、回收率、准确度和精密度、稳定性等方面进行验证;测定中剂量(2.25 mg·kg-1)灌胃给药后大鼠胆汁、尿液和粪便中ZCY-15的浓度,明确其在大鼠体内的排泄特征。3.药效学研究应用CCK-8方法,检测ZCY-15分别作用于Aβ1-42和喹啉酸诱导的AD细胞模型后细胞存活率,明确其对神经细胞保护作用和有效浓度范围。应用Annexin V-FITC/PI双染方法,检测有效浓度范围内ZCY-15分别作用于Aβ1-42和喹啉酸诱导的AD细胞模型后的抗凋亡作用。应用离子通道膜片钳法,检测ZCY-15对于NMDA受体的离子通道阻断作用。应用反向寻找药物靶点软件Swiss Target Prediction,预测ZCY-15的可能作用靶点。通过最大耐受量实验,检测小鼠对于ZCY-15的安全耐受量。应用Morris水迷宫实验,检测梯度浓度ZCY-15对于AD小鼠模型认知和学习能力的改善情况。应用免疫组化染色方法,检测梯度浓度ZCY-15对于AD小鼠模型脑内Aβ沉积的清除情况。应用Western Blot法,测定梯度浓度ZCY-15对于AD小鼠模型脑内预测靶点蛋白及相关通路蛋白水平的调控作用,验证药物作用靶点。应用ELISA方法,检测梯度浓度ZCY-15对于AD小鼠模型脑内多种炎症细胞因子的调控作用。结果:1.药动学和组织分布本部分建立的LC-MS/MS分析方法可同时用于血浆及组织匀浆中ZCY-15浓度,线性范围为1.95～1000 ng·m L-1,基质效应、回收率、准确度和精密度等均符合生物样本检测要求。梯度浓度ZCY-15灌胃给药后,雄、雌鼠组Tmax均小于1.4 h;雌、雄鼠组T1/2均大于4 h;雄鼠组Cmax、AUC0-∞均小于对应雌鼠组;雌鼠组清除率显著低于雄鼠组;雄、雌鼠组口服绝对生物利用度分别为（4.59±1.36）%、（5.81±0.86）%。灌胃给药后雄、雌鼠组大肠、小肠、胃中ZCY-15浓度最高,脂肪组织次之。在脑组织和海马中均检测到了ZCY-15的存在。血浆浓度随给药剂量的增加而成比例增加。2.代谢和排泄研究中剂量(2.25 mg·kg-1)ZCY-15灌胃给药后大鼠的血浆、胆汁、尿液和粪便中共检测出10种可能代谢产物,其中MP2F2为血浆和粪便共存代谢产物,MP3U1和MP4U2为血浆和尿液共存代谢产物,MP1为血浆独有代谢产物,MU3为尿液独有代谢产物,MF1、MF3、MF4为粪便独有代谢产物,MB1和MB2为胆汁独有代谢产物。以上代谢产物均通过Ⅰ相代谢反应中的氧化反应产生。本部分建立的LC-MS/MS分析方法用于检测胆汁、尿液、粪便中ZCY-15浓度,线性范围为1.00～200.0 ng·m L-1,基质效应、回收率、准确度和精密度等均符合生物样本检测要求。灌胃给药后大鼠胆汁中ZCY-15排泄率仅为（0.0002±0.00009）%;尿液样本未检出ZCY-15;粪便中ZCY-15排泄率仅为（0.99±0.57）%;药物可能主要以代谢产物的形式排出体外。3.药效学研究ZCY-15分别作用于Aβ1-42和喹啉酸诱导的AD细胞模型,表现出显著的神经细胞保护和抗凋亡作用,有效浓度范围分别为1.56～12.50μM、3.13～12.50μM,计算得EC50分别为4.04±0.20μM和7.34±0.45μM。ZCY-15不能阻断NMDA受体离子通道,明确其不是NMDA受体拮抗剂。反向寻找靶点软件计算得出,EPHX2可能是ZCY-15主要作用靶点。在0～5 g·kg-1剂量范围内ZCY-15对小鼠具有很好的安全性。Morris水迷宫实验结果显示,梯度浓度(1.5,3.0,4.5 mg·kg-1)ZCY-15可显著降低AD小鼠模型穿越平台潜伏期并提高了穿越平台次数。免疫组化染色结果显示,梯度浓度(1.5,3.0,4.5 mg·kg-1)ZCY-15可显著减少AD小鼠模型脑内Aβ沉积的细胞数。WB实验结果显示,梯度浓度(1.5,3.0,4.5 mg·kg-1)ZCY-15可显著下调AD小鼠模型脑内EPHX2、i NOS、GFAP蛋白的表达水平,上调PI3K、p-AKT、p-GSK-3β蛋白的表达水平,验证了靶点预测的正确性。ELISA实验结果显示,梯度浓度(1.5,3.0,4.5 mg·kg-1)ZCY-15可显著下调AD小鼠模型脑内TNF-α、IL-1β、IL-6炎性细胞因子水平,上调IL-3水平,对于Aβ沉积引发的炎症损伤起到了很好的保护作用。结论:1.药动学和组织分布研究首次建立了LC-MS/MS方法,应用于检测血浆及组织匀浆中ZCY-15浓度。ZCY-15能够经小肠快速吸收入血,短时间达到血药浓度峰值;血药浓度与给药剂量成比例增加,药动学表现为线性特征;口服绝对生物利用度偏低,存在性别差异;肾脏可能是主要排泄器官。ZCY-15能够透过BBB,对海马有很好的靶向选择性。2.代谢和排泄研究大鼠的血浆、尿液、胆汁和粪便中检测到10种代谢产物,均通过Ⅰ相代谢反应中氧化反应产生。首次建立了LC-MS/MS方法,应用于检测胆汁、尿液和粪便匀浆中ZCY-15浓度。ZCY-15在大鼠体内经胆汁和粪便的排泄量极少,主要是以代谢产物形式排出体外。3.药效学ZCY-15是一种具有较好的安全性和耐受性的新型环氧水解酶抑制剂,对于AD细胞模型展现出很好抗凋亡的保护作用;通过调控EPHX2等蛋白及通路,减少脑内Aβ沉积,降低脑内炎性损伤,改善了AD小鼠模型的认知和学习能力,展现出了很好的抗AD药效。