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木聚糖酶的应用范围很广,主要应用在工业中,但野生型的木聚糖酶难以满足工业生产中苛刻的反应条件,因此对野生型木聚糖酶的改造很重要,其中改造的重点是对木聚糖酶的催化活性和热稳定性进行改造。碳水化合物结合结构模块CBM具有独立的折叠构象,且不具有催化活性,能促进酶与底物的结合。通过将高温菌来源的CBM与木聚糖酶融合可以有效的提高木聚糖酶的热稳定性。课题组前期通过生物信息学分析将来源于海栖热袍菌的CBM9＿2（C2）划分为4个结构单元（U1、U2、U3、U4）,分别融合在黑曲霉木聚糖酶XynⅢ（X）的N端,得到了热稳定性提高的融合酶,但在表达过程中出现了大量包涵体,推测可能是因为一个完整结构的拆分不利于蛋白正确的折叠。所以本研究期望将C2各结构单元融合在X的C端得到可溶性表达。分别构建了含有单个结构元件的重组酶X-U1、X-U2、X-U3和X-U4;多个结构元件组合的重组酶X-U12、X-U123、X-U234和X-U34。通过对各个重组酶酶学性质的比较分析,推测C2各结构元件的功能,以期得到结构精简、热稳定性提高的性质优良的木聚糖酶,同时也希望获得对酶学性质有显著改良意义的功能模块。实验结果如下:（1）重组质粒的构建:含有单个结构元件的重组质粒pET21a-X-U1、pET21a-X-U2、pET21a-X-U3和pET21a-X-U4;含有多个结构元件的重组质粒pET21a-X-U12、pET21a-X-U123、pET21a-X-U234和pET21a-X-U34。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,挑取转化子进行筛选,测序正确后,经IPTG诱导表达重组酶。（2）最适pH(pHopt):纯酶X-U1和粗酶X-U3、X-U4、X-U34的pHopt均为3.8,与野生型X一致;粗酶X-U2、X-U12、X-U123的pHopt为4.2,较X提高了0.4个单位。其中X-U1在pH2.6至pH5.0间能保持75%以上的酶活。推测结构单元U1和U2与酶分子的pH适应性相关。（3）最适温度(Topt):粗酶X-U1、X-U3、X-U123的Topt均为46℃,与X一致;粗酶X-U2、X-U4、X-U12的Topt为50℃,比X提高了4℃。其中X-U4具有较宽泛的温度适应性,在34℃至54℃之间能保持89%以上的酶活。推测结构单元U2和U4与酶分子的Topt相关。（4）稳定性(t1/2):粗酶X-U1、X-U2、X-U3、X-U4在50℃的半失活时间t1/2依次为:231 min、30 min、500 min和340 min,而X的t1/2为:19.7min。粗酶X-U12和X-U123在50℃下的t1/2分别为23.9 min和10 min。推测结构元件U1、U3和U4与酶的热稳定性相关。（5）动力学测定:检测时所用的底物为山毛榉木聚糖,X-U1的Km值为6.853,Kcat值为146.7,对底物的亲和能力和催化能力较野生型X都有所降低。由此可见,C2是由不同结构元件组成的,其中结构单元U1和U2与酶分子的pH适应性相关;结构单元U2和U4与酶分子的Topt相关;结构元件U1、U3和U4与酶分子的稳定性相关。通过对C2结构元件功能的解析,为通过理性设计的酶分子改造提供了新的方法。