目的:以柠檬酸为碳源,采用微波加热一步法,制备表面经钝化剂修饰的荧光碳点,通过优化制备过程和反应条件,达到高荧光量子产率,并研究其发光机理。将碳点作为荧光标记物和大肠杆菌抗体分子结合,构建免疫荧光探针,以肠出血性大肠杆菌O157:H7为目标检测物,利用抗体-抗原特异性结合特性,观察大肠杆菌样本与探针结合后的荧光性,验证碳点在免疫荧光探针的构建是否成功,探索碳点基免疫荧光探针在大肠杆菌检测中的应用。期望制备一种低毒、经济、高效、稳定的碳点作为免疫荧光探针的荧光标记物,安全、高效地识别目标检测物。内容与方法:本论文拟在以下几个方面开展工作:(1)选择无水柠檬酸为碳源,聚乙烯亚胺(PEI)为修饰剂,通过微波法直接合成表面氨基化的碳点,无需再进行表面修饰,合成荧光性能良好的荧光碳点;系统研究微波时间、反应物配比等合成条件对碳点的产率、结构、组成、微观形貌、粒径大小及其分布的影响,揭示碳点的形成规律,进行透射电镜(TEM)、红外光谱(FTIR)、荧光光谱(FL)、紫外吸收光谱(UV)等表征手段,分析其成分、结构、形貌特征。(2)将碳点与大肠杆菌抗体通过酰胺化反应化学偶联,形成免疫荧光探针;选择与大肠杆菌类似的其他细菌作为对照模型,分析碳点与对照模型之间、免疫荧光探针与对照模型之间的相互作用及非特异吸附性能,研究免疫荧光探针的专一性。(3)探索基于碳点的免疫荧光探针在大肠杆菌检测中的应用,建立大肠杆菌浓度与探针荧光强度之间的关系,确定检测限。结果:(1)通过实验证明了PEI修饰的碳点荧光强度比无PEI修饰的碳点明显增强,同时增加了碳点表面的氨基功能基团,使未来免疫荧光探针的构建提供了基础。表征结果显示,碳点呈球形,粒径分布范围窄,平均粒径3 nm,小于10 nm,粒径小可以尽可能的减小对生物的干扰。碳点的荧光性能优良,荧光量子产率达到了46.7%,略低于作为标准物的硫酸奎宁(荧光量子产率为54%),达到了较高的荧光量子产率。而且光稳定性强,可长时间保持稳定的荧光强度。激发波长为360 nm时,具有最强的荧光发射峰,在440 nm左右。合成的碳点具有随着激发波长的红移,发射波长也随之红移的现象,在紫外光激发下发射蓝色荧光,在蓝色光激发下发射绿色荧光,在绿色光激发下发射红色荧光,因此可用于多色荧光成像。实验对制备碳点过程中的原料配比、pH、微波时间等实验条件进行了优化,碳点的最优合成条件是无水柠檬酸和聚乙烯亚胺配比3:1,并且此时的溶液pH值为5,呈弱酸性,微波时间为10 min。获得的碳点粒径均匀,分布范围窄,并且荧光性能优良。(2)通过碳点与E.coli O157:H7孵育,利用粒径小的优势,通过细菌的内吞作用,碳点进入到了细菌的内部,实现了对E.coli O157:H7的荧光标记和成像,说明了碳点具有好的生物相容性,能够穿透细胞壁进入细菌内部。此外,碳点对E.coli O157:H7的荧光标记,可以产生多色荧光,在紫外、蓝色和绿色光激发下,细菌呈现蓝色、绿色和红色荧光图像。在未来的荧光成像应用中,我们可以采用波长较长的激发光源,减少目标标记物自体荧光的干扰。采用MTT法测定了碳点的细胞毒性,结果表明即使在我们实验所用最高浓度1.2mg/mL时,细胞仍然具有80%以上的存活率,充分表明碳点的低细胞毒性的优点。(3)通过EDC/NHS偶联法将氨基修饰的碳点和抗体共价结合,构建了一种基于碳点的免疫荧光探针,使碳点这种新型的荧光纳米材料成功应用在了荧光抗体技术中。能够在较短时间内特异性的识别E.coli O157:H7,并且多色荧光成像。我们基于碳点构建的免疫荧光探针能够快速的检测样本中的E.coli O157:H7,检测灵敏度达到103CFU/mL,并可在短时间内(1 h)完成,可通过便携式光谱仪实现野外环境下的快速侦检。结论:我们成功制备了一种较高荧光量子产率的碳点,比将其应用到了荧光抗体技术中,构建了免疫荧光探针,特异性地识别了E.coli O157:H7,并达到了较高的灵敏度。我们相信,在目前的不足和问题解决之后,碳点作为一种新型的荧光纳米材料,在荧光免疫技术中的应用一定会得到极大地推动,有望成为具有自主知识产权的新型低毒生物传感器,拓展至病毒和其他细菌微生物的检测,在理论和实际应用中具有重要的价值。