目的:甲状腺癌的发病率正在全球范围内逐年攀升,甲状腺乳头状癌是最常见的一种分化型甲状腺恶性肿瘤,因其维持着甲状腺细胞的特征,恶性程度较低,通常可采用手术或放射性1311消融治疗。但部分患者在诊断时即已发生侵袭及远处转移,或接受治疗后出现复发,癌灶摄碘能力低下导致1311治疗效果不佳,患者的无病生存率较低、预后较差。目前尚无有效治疗难治性甲状腺癌的可靠手段,因此寻找可调节甲状腺癌生长进程的新型生物标志物并作为靶向位点,可能对甲状腺癌的诊治带来获益。细胞内存在能量代谢改变是肿瘤细胞的特征变化之一。业已证实,许多恶性肿瘤细胞存在有氧糖酵解(也称为Warburg效应)和谷氨酰胺代谢增加的现象。虽然谷氨酰胺是一种非必需氨基酸,但它是人体血液中含量最丰富的氨基酸,且谷氨酰胺是多种肿瘤细胞维持生长活力的重要营养素。虽然已有学者发现多种类型的血液和实体肿瘤中存在谷氨酰胺代谢的改变,但在甲状腺乳头状癌中,尚无关于谷氨酰胺及谷氨酰胺代谢相关蛋白的功能的研究性文章发表。因此,本研究旨在探讨甲状腺癌细胞的存活及生长是否需要谷氨酰胺,甲状腺癌细胞中是否存在谷氨酰胺代谢相关蛋白的表达异常,以及甲状腺癌中的谷氨酰胺代谢是否及如何发挥作用,寻找可能影响甲状腺癌生长和发展进程的生物靶点。方法:首先在无谷氨酰胺的细胞培养基中培养四种甲状腺乳头状癌细胞(K1、IHH4、BCPAP、TPC-1)和甲状腺非癌细胞Nthy-ori3-1,并与在正常培养基中生长的细胞进行对比,对比内容包括细胞的生长活力和增殖能力,检测方法为台盼蓝染色法、CCK8检测法和CTL细胞活力检测发光法。利用市售的RT2-PCR芯片检测并筛选甲状腺癌标本中氨基酸代谢相关基因的异常表达情况,检测样本包括甲状腺组织和甲状腺细胞系(6对新鲜收集的人甲状腺癌组织和配对的癌旁组织标本,以及IHH4、BCPAP细胞)。根据PCR芯片结果,对在甲状腺癌中表达异常的谷氨酰胺酶(GLS)的表达水平进一步确认,确认方法包括利用免疫组织化学染色法检测甲状腺癌组织和非癌组织中GLS的染色情况,并结合甲状腺癌患者的临床病理资料分析GLS的表达水平与相关临床因素的关系;Real-time PCR法检测90对甲状腺癌组织和配对的癌旁组织中GLS在mRNA水平的表达差异;Real-time PCR法和Western-blotting 法分别检测 K1、IHH4、BCPAP、TPC-1 和 Nthy-ori 3-1 细胞中 GLS的表达水平,并分析其差异。分别利用GLS的特异性化学抑制剂CB-839和BPTES以及基因沉默法靶向抑制上述四种PTC细胞中的GLS表达水平;谷氨酸、α-KG试剂盒检测谷氨酰胺代谢产物、Seahorse能量代谢分析仪检测PTC细胞的线粒体呼吸和耗氧量的变化。台盼蓝染色法、CCK8检测法和CTL发光法细胞活力检测试剂盒三种方式检测GLS表达水平降低后对PTC细胞的生长活力和增殖能力的影响。Transwell实验检测GLS被抑制后PTC细胞的迁移和侵袭能力的改变。Western-blotting 实验检测 PTC 细胞内 GLS 抑制前后 mTORCl 信号通路和 自噬标记分子 p-p70s6k、p70s6k、p-4EBP1、4EBP1、p-ULK1、ULK1、p-mTOR、mTOR、p62 和 LC3B的表达水平变化。Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术检测GLS抑制后对PTC细胞凋亡情况的影响。Real-time PCR法检测92对甲状腺癌组织和配对的癌旁组织中谷氨酰胺代谢相关转运体SLC1A5、SLC7A5和SLC6A14在mRNA水平的表达差异,免疫组织化学染色法检测甲状腺癌组织和非癌组织中SLC1A5、SLC7A5和SLC6A14的染色情况,并结合甲状腺癌患者的临床病理资料分析上述三个转运体的表达水平与相关临床因素的关系。同时免疫组织化学染色法检测甲状腺癌组织中侵袭标记分子E-cad、β-cat、MMP-9和VEGFA的表达水平,综合分析甲状腺癌中转运体的表达水平与侵袭的相关性。结果:台盼蓝染色法、CCK8检测法和CTL细胞活力检测发光法结果一致证实四种PTC细胞系K1、IHH4、BCPAP、TPC-1在无谷氨酰胺的培养状态下,细胞活力和生长增殖能力显著降低(p<0.05),而甲状腺非癌细胞Nthy-ori 3-1则无明显变化(p>0.05)。RT2-PCR芯片筛选出的差异表达基因中仅GLS在PTC中表达水平上调(p=0.0015),有统计学差异。90对甲状腺乳头状癌组织标本的Real-time PCR结果证实,GLS在PTC组织中的mRNA表达明显升高(P<0.001)。免疫组织化学染色证实GLS在PTC中表达于细胞浆内,且染色强度高于非癌甲状腺组织(P<0.001),分析患者的临床病理资料发现高GLS染色与PTC患者发生腺外侵袭相关(p=0.005)。Real-time PCR 和 Western blotting 实验检测K1、IHH4、BCPAP、TPC-1 和 Nthy-ori 3-1细胞中GLS在mRNA和蛋白水平的表达情况,四种PTC细胞中的GLS mRNA水平均高于Nthy-ori3-1细胞(P<0.01),GLS的蛋白表达水平也明显高于非癌甲状腺细胞。抑制PTC细胞中的GLS表达后,K1、IHH4、BCPAP、TPC-1细胞中的谷氨酰胺代谢中间产物谷氨酸和α-KG的浓度降低,提示谷氨酰胺代谢过程受到了抑制。GLS表达降低后,PTC细胞的线粒体呼吸能力降低,包括基础耗氧量和最大耗氧量水平均有所下降。PTC细胞的生长活力、增殖能力、迁移和侵袭能力在GLS表达降低后均明显减弱,同时Western blotting实验证实mTORC1信号通路标记分子(p-p70s6k、p70s6k、p-4EBP1、4EBP1、p-ULK1、ULK1、p-mTOR、mTOR)表达量降低,自噬标记分子p62、LC3B-Ⅰ表达降低,LC3B-Ⅱ表达增加,提示GLS表达受到抑制后引起mTORC1信号通路活性降低,并诱导细胞发生自噬。流式细胞术结果显示,PTC细胞发生凋亡的比例在GLS表达降低后明显升高。92对甲状腺乳头状癌组织标本的Real-time PCR结果证实谷氨酰胺代谢相关转运体SLClA5、SLC7A5和SLC6A14在mRNA水平和蛋白水平均表达升高(p<0.001),其中男性患者的SLC7A5的蛋白表达水平高于女性(p=0.003)。SLC1A5和SLC6A14的表达水平与β-cat相关,SLC7A5和SLC6A14的表达水平与肿瘤侵袭标记分子MMP9和VEGFA正相关。结论:本研究主要证实了甲状腺乳头状癌细胞存在谷氨酰胺依赖的现象,并且利用RT2-PCR芯片进行基因筛选,发现人甲状腺乳头状癌中的谷氨酰胺酶和谷氨酰胺代谢相关转运体SLC1A5、SLC7A5和SLC6A14的表达水平异常升高。上述结果在后续的Real-time PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学染色实验中得到了进一步确认和证实。我们发现谷氨酰胺酶的表达水平与甲状腺癌的腺外侵袭是显著相关的,SLC1A5、SLC7A5和SLC6A14的表达水平与肿瘤侵袭标记分子β-cat、MMP9和VEGFA正相关。此外,我们深入探究了 GLS在甲状腺乳头状癌中的作用方式及可能的发生机制。实验证实,降低GLS的表达水平后,PTC细胞内的谷氨酰胺代谢过程明显受到抑制,同时线粒体呼吸水平下降。我们分别采用了化学药物抑制剂和基因沉默两种方式实现对PTC细胞内GLS表达水平的抑制,两种处理方式均降低了甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力、存活能力以及迁移和侵袭能力。作用机制方面,谷氨酰胺酶的抑制促使雷帕霉素复合物1(mTORC1)信号通路失活,因而促进了细胞发生自噬和凋亡。总的来说,上述研究结果表明,谷氨酰胺酶介导的谷氨酰胺依赖现象可能会成为甲状腺乳头状癌的潜在治疗靶点。