论文部分内容阅读
本论文研究了重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF—related apoptosis inducing ligand，TRAIL）的毕赤酵母发酵工艺优化、蛋白纯化工艺及生物活性分析，并利用生物软件和Internet对其二、三级结构预测等方面进行了研究。 摇瓶培养确定了最适培养基为BMGY/BMMY，最适pH为5.5—6.0，最佳甲醇诱导浓度1％，最适诱导时间为96小时。在此基础上，进行了5L发酵罐的高密度培养，采用补料分批培养，最终确定了高密度发酵工艺。 利用30％—60％饱和度（NH4）2SO4分级沉淀对发酵上清预处理，经Sephadex G25凝胶脱盐，Q-Sepharose-Fast Flow阴离子层析和SephadexG50 fine凝胶层析分离，最终得到的rhsTRAIL蛋白纯度为95％。经过电泳和ESI-MS确定蛋白的单体分子量为22,000Da，二聚体分子量为44,000Da，等电点为4.8—5.2，并且证明了其没有发生N-糖基化，与所克隆的TRAIL氨基酸序列中没有存在N糖基化位点是一致的。 形态学上观察了rhsTRAIL对肝癌细胞SMMC7721和BEL7402的诱导凋亡活性，发现rhsTRAIL在0.5μg/ml时显示了很好的诱导凋亡活性，并通过电镜观察rhsTRAIL诱导后的SMMC7721细胞，证实了凋亡；同时提取凋亡细胞DNA，进行琼脂糖电泳分析，在分子水平证明凋亡；最后利用SMMC7721细胞分组加入纯化后的rhsTRAIL蛋白，结果显示纯化蛋白含量在0.01μg/ml时细胞就呈现了诱导凋亡活性。 利用Antheprot软件和Internet对克隆的rhsTRAIL片段（114aa—281aa）进行了二级和三级结构预测，显示rhsTRAIL是一种混合型蛋白，三级结构模拟显示胞外C段（114aa—281aa）形成了8条β折叠结构，主要是平行β折叠，形成了典型的β夹心结构域。