目的:脓毒症肠损伤增加脓毒症死亡率,但缺乏有效治疗靶点和措施。肠道菌群和肠道固有免疫细胞在维持肠道稳态中具有重要作用,然而二者在脓毒症发生发展及转归过程中变化及相关性不明确。脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症表现类似于脓毒症反应。本实验探索内毒素血症发生发展及转归过程中小鼠肠道菌群及固有免疫的变化特征及二者的相关性,拟为研究脓毒症肠损伤的病理机制及防治措施提供启示。方法:第一部分小鼠内毒素血症模型建立及评价24只8-10周雄性C57BL/6J小鼠被随机分为对照组(n=6)和内毒素血症组(n=18),内毒素血症组小鼠单次腹腔注射脂多糖(LPS,10mg/kg),对照组小鼠给予等量0.9%Na Cl,观察小鼠造模后1周内每日的临床症状评分、腹泻评分、体重及生存率等一般情况变化。另选18只8-10周雄性C57BL/6J小鼠,随机分为Day0组、Day2组和Day7组,每组n=6。Day2及Day7组小鼠接受单次LPS(10mg/kg)腹腔注射并在注射后第2d和第7d被处死,Day0组小鼠注射等量0.9%Na Cl并在注射后立即被处死,收集血清及大肠组织。采用流式微球检测技术(CBA)检测外周血炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)水平变化;苏木精-伊红(HE)染色法检测肠组织病理变化;实时定量基因扩增荧光检测系统(RT-q PCR)检测大肠炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)m RNA表达量变化。第二部分内毒素血症小鼠肠道菌群和固有免疫变化特征及相关性分析24只8-10周雄性C57BL/6J小鼠被随机分为Day0组、Day2组和Day7组,每组n=8。造模方法及样本采集时间点同第一部分,收集大肠并分离固有层免疫细胞,流式细胞术分析大肠MNPs和ILCs数量及表达的细胞因子(MNPs:IL-10,TNF-α;ILCs:IL-22)的变化;采集盲肠及大肠粪便,采用16S r RNA gene测序技术分析肠道菌群多样性、物种组成变化;最后对肠道菌群和固有免疫行Sperman相关性分析。结果:第一部分小鼠内毒素血症模型建立及评价和正常对照组比,内毒素血症组小鼠出现1周生存率显著降低(P<0.05),在LPS处理后第2d临床症状评分及腹泻评分均显著升高并达到最高水平(均P<0.001),体重明显减轻(P<0.001),外周血炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)显著升高(均P<0.05),大肠炎症基因表达显著增加(IL-1β,P<0.05),大肠病理损伤明显;至第7d,临床症状评分接近稳态期水平,腹泻基本消失,体重明显回升,外周血炎症因子基本恢复至稳态期水平,大肠病理损伤好转。确定Day0为稳态期,Day2为症状明显期,Day7为症状恢复期。第二部分内毒素血症小鼠肠道菌群和固有免疫变化特征和相关性分析2.1内毒素血症小鼠肠道菌群变化特征PCo A分析显示在内毒素血症发生发展及转归过程中小鼠肠道菌群发生了显著的变化(P=0.001)。在门水平。相对于稳态期(Day0),厚壁菌门(Firmicutes)丰度先在症状明显期(Day2)减少,后于症状恢复期(Day7)有所恢复,变形菌门(Proteobacteria)丰度先增多后显著减少(P<0.05),螺旋体菌门(Saccharibacteria)丰度则持续减少(P<0.01)。在属水平,产丁酸盐细菌拟杆菌属＿S24-7＿组(norank＿f＿＿Bacteroidales＿S24-7＿group)和毛螺菌属(Lachnospiraceae)丰度于症状明显期(Day2)减少,在症状恢复期(Day7)有所恢复甚至高于稳态期(Day0)。肠球菌属(Enterococcus)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)等机会致病菌丰度在症状明显期(Day2)显著增多(均P<0.01),但均在症状恢复期(Day7)消失。2.2内毒素血症小鼠肠道固有免疫变化特征在内毒素血症发生发展及转归过程中,小鼠肠道炎性巨噬细胞(IMs)持续增加(P<0.01),常驻巨噬细胞(RMs)持续减少(P<0.05)。和稳态期(Day0)小鼠比,症状明显期(Day2)小鼠肠道DCs显著减少(P<0.01),其亚群促炎性DCs(CD103~-DCs)显著增多(P<0.001),调节性DCs(CD103~+DCs)显著减少(P<0.001),但均在症状恢复期(Day7)恢复至稳态期水平。在症状明显期(Day2),IMs分泌的TNF-a和RMs分泌IL-10均显著增多(均P<0.05),后在症状恢复期(Day7)基本恢复至稳态期水平;在症状明显期(Day2),ILC3分泌IL-22显著减少(P<0.01),在症状恢复期(Day7)仍不能完全恢复至稳态期(Day0)水平。2.3内毒素血症小鼠肠道菌群和固有免疫的相关性通过Sperman相关性分析发现:在肠道菌群属水平丰度前50的物种中,有22个细菌物种和固有免疫因子存在显著相关。在所有固有免疫因子中,TNF-α~+IMs相关的细菌物种数最多(共12种),且与拟杆菌属＿S24-7＿组和毛螺菌属丰度显著负相关(均P<0.05),与肠球菌属、大肠杆菌-志贺菌属丰度显著正相关(均P<0.05)。其次为CD103~+DCs、CD103~-DCs、IMs和IL-10~+RMs(均为6种),而ILC2、IL-10~+IMs和TNF-α~+RMs和肠道菌群无显著相关性。拟杆菌属＿S24-7组显著相关的固有免疫因子数最多(共6个),其次为肠球菌属和大肠杆菌-志贺菌属(均为5个),拟杆菌属＿S24-7组和ILC3、IL-22~+ILC3、CD103~+DCs呈显著正相关(均P<0.05),和CD103~-DCs,TNF-α~+IMs,IL-10~+RMs呈显著负相关(均P<0.05);机会致病菌肠球菌属和大肠杆菌-志贺菌属与IL-22~+ILC3、CD103~+DCs呈显著负相关(P<0.05),而与CD103~-DCs,TNF-α~+IMs,IL-10~+RMs呈显著正相关(均P<0.05)。结论:1.在小鼠内毒素血症的发生发展及转归过程中,肠道菌群发生了显著的变化。主要表现为拟杆菌属＿S24-7＿组在肠道损伤时减少,在肠道损伤好转时大量增加;肠球菌属和大肠杆菌-志贺菌属仅在肠道损伤时出现并大量增加,在稳态及肠道损伤好转时不能被检出。2.在小鼠内毒素血症的发生发展及转归过程中,肠道固有免疫发生了显著的变化。主要表现为IMs表达的TNF-α在肠道损伤时大量增多,在肠道损伤好转时显著减少,但RMs表达的TNF-α无明显变化;ILC3表达的IL-22在肠道损伤时显著减少,在肠道损伤好转时仍被抑制。3.在小鼠内毒素血症的发生发展及转归过程中,肠道菌群变化和肠道固有免疫变化存在一定关联。主要表现在TNF-α~+IMs显著相关的细菌物种数最多,其与拟杆菌属＿S24-7＿组呈显著负相关,与肠球菌属、大肠杆菌-志贺菌属呈显著正相关。拟杆菌属＿S24-7＿组显著相关的固有免疫因子数最多,其和ILC3、IL-22~+ILC3、CD103~+DCs呈显著正相关,和CD103~-DCs、TNF-α~+IMs、IL-10~+RMs呈显著负相关。4.本研究结果有望为研究脓毒症肠损伤的病理机制及防治措施带来启发。