革兰氏阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)是公认的主要牙周可疑致病菌。它的生长主要依赖血红素提供的铁和卟啉。在人体中，血红蛋白是主要的铁源，它由血红素和珠蛋白构成。人的龈沟液特别是感染的牙周袋中富含血红蛋白，P.g优先利用血红蛋白来源的血红素获得铁和卟啉，其次是宿主其他含有铁和卟啉的蛋白，包括血红素结合蛋白(hemopexin)、结合珠蛋白(haptoglobin)和血清白蛋白(serumalbumin)。这些蛋白在龈沟液中分解出的铁和卟啉也可以作为P.g营养源的补充，但是血红蛋白来源的血红素被认为是龈沟环境中P.g主要的生长因子来源。P.g在铁缺乏的环境中也可以从其他蛋白中获得铁离子，比如转铁蛋白(transferrin)和乳铁蛋白(lactoferrin)，但这种额外获取铁的能力与P.g的致病性没有相关性，换句话说，P.g的致病性与它结合血红蛋白/血红素有关。一些细菌主要通过相关的特异受体结合血红素获取铁源，比如大肠杆菌(Escherichiacoli)致病菌株EB1能分泌一种双功能的蛋白，既是血红蛋白水解酶也是铁携带体。血红素和其他携铁载体的转运过程需要能量转导蛋白TonB的介入，也就是说外膜受体通常指的都是TonB依赖性受体。 血红素与P.g很多功能相关。首先，细胞表面血红素的聚集具有防御功能以抵抗其他产氧菌种产生的氧的侵袭。其次，血红素的获取是细菌能量代谢的关键。P.g对血红素的获取并使之发挥功能的过程除了TonB依赖性外膜受体的参与，还包括细胞表面蛋白Kgp的溶血，血红蛋白的水解和血红素的有效获取三个步骤。P.g的二种主要胰酶样蛋白酶，赖氨酸特异蛋白酶(Lys-Xaa-specificproteiase，Kgp)和精氨酸特异蛋白酶(Arg-Xaa-specificproteiase，RgpA)是复合蛋白，包括一个半胱氨酸蛋白酶区和C端凝血素区(HA1、HA2、HA3、HA4)。其中分子量为15KDa的HA2为高度保守区域，已被识别，称之为血红蛋白受体(Hbreceptor)。Kgp、RgpA和血细胞凝集素(hemagglutininA，HagA)中都包含HA2。Kgp是一个血红蛋白蛋白酶，其中的HA2区域主要结合酶底物，也有报道它可以结合血红素，提示其可作为嗜铁体捕获血红素。kgp、rgpA和hagA编码的蛋白，外膜有HA2表达，并且对血红蛋白的结合是高亲合性的。原卟啉与血红素、血红蛋白竞争，优先结合HA2，提示HA2对血红素的识别只通过卟啉介导。 本研究的目的是克隆表达P.g蛋白酶凝血素HA2基因，获得重组HA2。用于HA2的单克隆及多克隆抗体的制备。为进一步研究HA2的致病性以及抗P.gHA2特异性抗体对牙周保护作用做准备，并为将来研究以HA2为基础的牙周疫苗奠定基础。 方法：提取P.g基因组DNA，以HA2敏感特异引物进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)，扩增P.gHA2基因，用pGEM-T克隆载体、大肠杆菌DH5α克隆P.gHA2基因，以表达载体pQE30构建重组表达质粒，IPTG诱导大肠杆菌M15表达P.gHA2基因蛋白，用镍柱亲合层析法对重组蛋白进行分离纯化。 结果：P.g基因组DNAPCR扩增出约400bp的目的片段；原核表达质粒pQE30-HA2经酶切鉴定插入片段分子量与预期大小一致；转化受体菌E.coliM15后IPTG诱导，用抗组氨酸的抗体进行免疫印迹显示目的蛋白大多以包涵体形式表达。 结论：成功克隆重组表达了P.gHA2基因，为进一步研究HA2的生物学性质及免疫学特性奠定了基础。