基因的原位编辑修饰一直被认为是生物学实验中最困难也是最关键的部分,研究者通过对特定基因的原位编辑可以了解更多关于基因的功能、基因所调控的信号通路的细节。本文对于目的基因的原位编辑主要是通过CRISPR/Cas9技术将光转蛋白基因序列敲入果蝇的多个基因位点中。从细菌中发现的CRISPR/Cas9系统在许多生物体中被证明是非常高效强大的基因编辑工具。成规律的成簇的非连续的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是一类在细菌中发现的DNA片段,在这些片段中包含了来自于攻击过这类细菌的病毒的DNA片段。这些片段最初是被细菌用来检测和摧毁含有与之相似序列的病毒,其和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成了细菌的防御免疫系统。人们通过基因工程改造了Ⅱ型的CRISPR/Cas系统即我们所称的CRISPR/Cas9系统,使得基因的原位编辑效率大大提高。形成素基因是TGF-β信号通路的配体,其调控生物体发育,pattern的形成和干细胞的分化。它们的产物可以通过扩散形成的浓度梯度来决定不同位置的细胞的命运。故而研究形成素的扩散方式和它们如何传递位置信息及发育指令是极具科研意义的。形成素和一些标签的融合蛋白可以直观且准确的反映形成素在生物体内的分布、移动情况,但由于较难构建故而成功的例子不多。本课题尝试着在Dpp的C端、Wg的N端和mEFTu1的终止码前敲入光转蛋白dendra和相应蛋白标签,从而标记内源的Dpp、Wg[3]和mEFTu1待后续研究使用。观察到与标记Dpp的N端不同,在Dpp的C端敲入dendra蛋白影响了Dpp的功能,导致果蝇在幼虫期翅盘严重变形和缺失,其纯合致死,但是对果蝇成虫期的翅膀和眼睛表型影响不大。本课题尝试在Wg的N端敲入dendra蛋白失败,并没有获得阳性KI果蝇品系。在对mEFTu1进行KI操作时,通过引入可视的表型标签优化了后续鉴定步骤,并成功将目的片段敲入目的位点。但经DNA测序检验后,发现在原PAM位点附近发生了移码突变。这一情况与去年的文献报道[65]类似,即CRISPR/Cas9系统可能会在基因编辑过程中发生脱靶和引入多余的突变,这极大的限制了该系统的使用。此外,不同的基因在编辑难度上存在差异即基因的可编辑性不同。