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目的研究pre-miRNA在胰腺癌细胞株PANC-1与正常胰腺组织中启动子区的甲基化程度差异,找到与胰腺癌相关、存在异常甲基化的miRNA。方法采用“MeDIP(Methylated DNA Immunoprecipitation) +甲基化芯片”方法分别对在胰腺癌细胞株PANC-1和正常胰腺组织进行芯片分析,从中筛选出在PANC-1与正常胰腺组织中存在启动子区甲基化峰值的miRNA。从PANC-1和正常胰腺组织中提取基因组DNA,进行重亚硫酸盐处理,以处理后的DNA为模板进行BSP,2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物,将纯化后产物进行TA克隆,挑选阳性单克隆菌落进行菌液PCR,挑选阳性菌液送测序,对芯片结果进行验证。提取胰腺癌细胞株BXPC-3、CFPAC-1、PANC-1、SW1990的基因组DNA,进行BSP反应(bisulfite genomic sequencing PCR,重亚硫酸盐测序PCR),对PCR产物进行COBRA酶切(combined bisulfite restriction analysis,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法),检测miRNA在多种胰腺癌细胞株中的甲基化状态。结果测序结果显示:miRNA-615、miRNA-663、miRNA-663b在PANC-1中的甲基化率明显高于正常组织(60.6%:7.6%,88.8%:22.2%,94.4%:13.0%),miRNA-675在PANC-1和正常胰腺组织中的甲基化率无明显差异(76.0%:100%);COBRA示:miRNA-663在四种胰腺癌细胞株中均有不同程度的甲基化,而miRNA-615在CFPAC-1中,miRNA-663b在SW1990中,miRNA-675在BXPAC无明显甲基化。结论“MeDIP +甲基化芯片+TA克隆测序”可以作为准确筛查异常甲基化的miRNA的有效方法。在四种胰腺癌细胞株中miRNA-615、miRNA-663、miRNA-663b、miRNA-675均存在不同程度的甲基化。