【摘 要】
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化学农药的使用降低了病虫害对农作物的危害,极大地提升了农业产量。但是由于化学农药的过度使用,致使农药残留、地下水、土壤污染等问题日趋严重。因此,环境友好型的绿色农药的研发对生态环境保护,推动绿色农药科技兴农建设具有重要意义。本论文旨在对陆生植物来源的真菌培养过程中加入海水,进行高盐胁迫,以期获得结构新颖、生物活性优良的天然化合物,将来源于芦荟秸秆优势菌株进行海水静置发酵,并利用活性追踪技术对其次级
【基金项目】
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国家自然基金面上项目(3157011254:海藻内生真菌农用生物活性物质及其合成的研究);
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化学农药的使用降低了病虫害对农作物的危害,极大地提升了农业产量。但是由于化学农药的过度使用,致使农药残留、地下水、土壤污染等问题日趋严重。因此,环境友好型的绿色农药的研发对生态环境保护,推动绿色农药科技兴农建设具有重要意义。本论文旨在对陆生植物来源的真菌培养过程中加入海水,进行高盐胁迫,以期获得结构新颖、生物活性优良的天然化合物,将来源于芦荟秸秆优势菌株进行海水静置发酵,并利用活性追踪技术对其次级代谢产物进行分离纯化,为新型绿色农药设计开发提供理论和实验基础。使用组织分离法从鲍鱼、芦荟秸秆、粗枝软骨藻以及石莼中分离得到4株真菌,以菌株种类、培养基类别和培养时间为变量因素,使用4种不同培养基优化培养2周(2 W)和4周(4 W),比较其次级代谢产物量以及抑菌生物活性。通过对次级代谢产物的产量和抑菌活性的对比发现,在RICE培养基培养4 W后,各菌株可达到最大次级代谢产物量,4种菌株的代谢产物总量由高至低依次为O-02、U-04、A-01、C-03;RICE培养基次级代谢产物对6株指示菌株具有广谱抑菌性。最终确定生产力和抑菌活性较强的优势菌株为来源于芦荟秸秆的菌株O-02,RICE培养基(海水胁迫),最佳培养时间为4 W。经过分子生物学鉴定,O-02菌株为Aspergillus ochraceu。将菌株O-02使用RICE培养基进行30 L较大规模静置发酵4 W,得到乙酸乙酯相浸膏约400 g。对其进行VLC梯度洗脱,得到Fr.1-Fr.15共15个组分。分别以6株指示菌株、紫背浮萍、盐水卤虫、无翅蚜虫为靶标生物,进行动植物病原菌、水生动物、水生植物及植物害虫的活性筛选试验,结果发现组分Fr.4、Fr.8~Fr.13等生物活性较好。使用制备板、硅胶柱和凝胶柱等多种柱层析的方法对上述组分进行进一步分离纯化,得到32个单体物质。分别选取质量较大的单体物质进行抗卤虫活性和抑菌活性筛选,通过抑菌活性筛选结果发现,化合物AO-17具有一定的广谱抑菌性,对除苏云金芽孢杆菌之外的5株指示菌均有一定的抑制活性,对枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的抑制作用最强,抑菌圈直径分别为22 mm和20 mm(阳性对照分别为30 mm和32 mm);其次,化合物AO-02、AO-09、AO-10和AO-24均分别对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白菜黑腐菌等单一指示菌的高抑制活性,说明其抑菌活性具有一定的选择性;抗卤虫活性筛选结果发现,各单体物质在高浓度下均对卤虫表现出一定的抑制活性,其中以化合物AO-18、AO-23、AO-24、AO-26、AO-27、AO-28活性最强,半致死浓度分别为0.134 mg/m L,0.111 mg/m L,0.108 mg/m L,0.112 mg/m L,0.121mg/m L,0.111 mg/m L,可以推测其具有较强的卤虫致死活性。根据以上单体物质活性筛选试验结果发现,AO-17和AO-24具有较强的杀卤虫活性的同时,也具有较强的选择抑菌性,可作为后续深入研究构效关系的重点。
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