脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是导致老年性黄斑变性(age—related macular degeneration，AMD)、病理性近视、眼组织胞浆菌病、血管样条纹等多种疾病视力严重下降的重要原因。现有的治疗方法如常规激光光凝，经瞳孔温热疗法(transpupillary themlotheraPy，TTT)、视网膜下CNV摘除、黄斑转位手术等，大多不具选择性而且容易破坏正常视网膜结构和功能。近年来开展的光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)，因为光敏剂选择性聚集于CNV部位以及对病变部位采用特定波长的激光照射的双重选择性能够特异性地作用于CNV，而几乎不损伤周围正常组织，正成为一种新的、安全有效的治疗方法。 目前国内外眼科临床PDT所用的光敏剂Visudyne，是美国FDA批准的唯一用于眼科临床的光敏剂，该药价格昂贵，对患者和社会造成了巨大的经济负担。海姆泊芬是近年来国内研制的一种新型光敏剂，具有结构明确、成分单一、光敏作用强、体内分布和消除迅速、毒副反应小等特点。临床上已广泛应用于皮肤鲜红斑痣的治疗，眼科方面已有关于海姆泊芬PDT有效封闭角膜新生血管以及对正常视网膜生物学效应的实验性研究。本研究通过观察海姆泊芬PDT对BN大鼠CNV以及人脐静脉内皮细胞HUVEC的作用，评价海姆泊芬PDT治疗BN大鼠CNV的可行性和有效性，并初步阐明其作用机制，为海姆泊芬PDT的临床应用提供实验依据和理论基础。 第一部分半导体激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管形成目的观察不同能量的810 nm半导体激光光凝对棕色挪威(Brown Norway，BN)大鼠CNV形成的影响，探讨诱导CNV模型的合适激光参数。方法健康BN大鼠49只，随机取7只作为对照，其余42只等分为3组。采用功率分别为120 mW、140 mW和160 mW，光斑直径75 um，曝光时间100 ms的810 nm半导体激光光凝大鼠双眼视网膜，光凝后1、3、7、14、21、28及56天行眼底、眼底荧光血管造影(fundus nuorescein angiography，FFA)／吲哚菁绿血管造影(indocyaninegreen angiography，ICGA)、光学显微镜、CD<,34>免疫组织化学以及透射电子显微镜检查。结果120 mW、140 mw和160 mw三组光凝后7天出现CNV；21天CNV达到高峰，此时以FFA和。ICGA检查证实的CNV成模率分别为45．54％、88．18％、85．45％及45．54％、89．09％、91．82％；28天CNV仍处于高峰状态，56天CNV有所减少。结论810 nm半导体激光可成功诱导BN大鼠CNv模型，成模率高，成模高峰位于激光后21天。造模的理想参数为：功率140 mW，光斑直径75um，曝光时间100 ms。 第二部分海姆泊芬在BN大鼠眼底组织分布的研究 目的观察海姆泊芬静脉注射后不同时间在BN大鼠CNV眼底组织的浓度分布变化和差异，探讨PDT激光照射的合适时机。方法双眼CNV成模BN 大鼠20只，随机取4只作眼底血管造影，尾静脉注射10 mg／Kg海姆泊芬后，采用SLO行视网膜、脉络膜血管及CNV连续、动态观察；其余16 只大鼠随机等分为8组，其中1组为空白对照组，其余7组在10 mg／kg海姆泊芬静脉给药后于3、5、15、30、60、120分钟和24小时分别处死，制作石蜡切片，荧光显微镜下观察不同组织的荧光强度。结果眼底血管造影和荧光显微镜检查均显示：在静脉注射海姆泊芬(10mg／kg)后3分钟时，脉络膜和视网膜血管及CNV中海姆泊芬浓度达到高峰；15分钟时CNv与脉络膜、视网膜的浓度差异扩大；30分钟时脉络膜、视网膜浓度接近消失，CNV中仍显示较高浓度，CNV与脉络膜、视网膜之间浓度差异显著。结论静脉注射海姆泊芬(10mg／kg)后30分钟，BN大鼠CNV与脉络膜和视网膜的药物浓度差异最大，且脉络膜、视网膜浓度接近消失，该时间点可作为海姆泊芬PDT治疗BN大鼠CNV的适宜照光时机。 第三部分海姆泊芬光动力治疗BN大鼠CNV的研究 目的观察相同海姆泊芬药物剂量、不同能量密度630nm激光照射对BN 大鼠CNV的影响，评价海姆泊芬PDT治疗BN大鼠CNV的可行性。方法双眼CNV成模BN大鼠48只，随机等分为8组。1组为空白对照，1组单纯注射海姆泊芬，3组不注射海姆泊芬，单纯接受与PDT相同参数的630 nm激光照射，另3组为PDT组，尾静脉注射海姆泊芬(10 mg/kg)30分钟后开始激光照射，所用参数：光斑直径3 mm，照光时间60 S，输出功率密度分别为600 mW/cm<’2>、800 mW/cm<’2>和1000 mW/cm<’2>(能量密度分别为36 J/cm<’2>、48 J／cm<’2>、60 J／cm<’2>)。治疗后1、7、1 4天分别进行眼底、FFA、ICGA、光学显微镜以及透射电子显微镜检查，观察CNV及周围组织变化。结果治疗后1天，各组CNV荧光渗漏无改变。治疗后7天和14天，PDT 800mW/cm<’2>和1000 mW/cm<’2>组以及单纯照光1000 mW/cm<’2>组CNV渗漏好转率均高于对照组，PDT 800 mW/cm<’2>和1000 mW/cm<’2>组渗漏停止率高于其他组别，但两组之间没有显著差异。单纯给药组、单纯照光600 mW/cm<’2>和800 mW/cm<’2>组以及PDT 600 mW/cm<’2>组随访中均未见CNV渗漏改变。ICGA显示PDT 800 mW/cm<’2>和1 000 mW/cm<’2>组以及单纯激光1 000mW/cm<’2>激光后1天照射部位可见脉络膜无灌注，14天时PDT 800 mW/cm<’2>组脉络膜无灌注基本恢复，但PDT 1 000 mW/cm<’2>组和单纯激光1000mW/cm<’2>组仍可见明显脉络膜无灌注。结论选择适当参数海姆泊芬PDT能有效闭锁BN大鼠CNV。当静脉注射海姆泊芬剂量为10 mg/kg时，推荐的630 nm半导体激光参数为：光斑直径3 mm，照光时间60 S，输出功率密度800 mW/cm<’2>，可达到对周围视网膜、脉络膜损伤最小、疗效最好的目的。 第四部分海姆泊芬光动力治疗对血管内皮细胞增殖及凋亡的影响目的观察不同浓度的海姆泊芬PDT对体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞增殖和凋亡的影响，探讨海姆泊芬PDT治疗CNV的可能机制。方法取体外培养HUVEC细胞分为8组，1组为空白对照，l组单纯激光照射，3组细胞给予与PDT组相同浓度的海姆泊芬但不接受激光照射，另外3组细胞分别加入浓度为200μg／ml、100μg／ml和50μg／ml海姆泊芬，15分钟后用波长630 nm的激光照射，激光光斑直径3 mm，功率密度2000 mW／cm<'2>，照光时间2 min。于激光照射后4小时和24小时分别收集细胞，采用MTT和PI法观察海姆泊芬PDT对HUVEC细胞体外增殖、细胞周期的影响，Hoechst 33258荧光染色、透射电子显微镜观察HUVEC细胞形态学变化，Annexin V／PI双染法经流式细胞仪检测HUVEC细胞凋亡率。结果海姆泊芬浓度为100μg／ml和200μg／ml的PDT组激光后4小时和24小时，HUVEC活细胞数明显减少，大部分细胞周期停止于GO／G1期；透射电镜和Hoechst 33258荧光染色可见到典型的凋亡细胞形态；Annexin V／PI双染法流式细胞仪检测到HUVEC细胞凋亡率升高。结论100μg／ml或200μg／ml海姆泊芬PDT，可使培养的HUVEC体外增殖明显受抑制，同时细胞凋亡明显增加。抑制细胞增殖同时诱导细胞凋亡可能是海姆泊芬PDT闭锁CNV的机制。