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研究背景:Nedd8(Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Downregulated 8)是一种类泛素蛋白,在 E1 活化酶(Nedd8-activatingenzyme),E2 结合酶(Nedd8-conjugatingenzyme)以及具有底物特异性的 E3(Nedd8-ligase)连接酶参与下,Nedd8可以共价修饰到底物蛋白上,这个过程叫Neddylation。Nedd8从底物蛋白上被解离的过程叫去Neddylation,这个过程需要去Neddylation酶的参与,去 Neddylation 酶包括JAB1(Jun Activation Domain-Binding Protein)与NEDP1(Nedd8-Specific Protease 1)两种。Nedd8的主要底物是 Cullin 蛋白,当Cullin蛋白被发生Neddylation修饰以后,可以激活其作为泛素连接酶的活性,促进蛋白的泛素化降解过程。目前也发现有越来越多的非Cullin家族的蛋白被证明是Nedd8的底物,比如P53,MDM2,Smurf1,Smurf2等。Nedd8通路缺失在多种物种中具有胚胎致死效应,且在口腔鳞状细胞癌、结直肠癌中高表达,在神经退行性疾病存在缺陷。蛋白质在细胞内的正确定位对其发挥生物学功能具有重要意义。蛋白翻译后修饰可以影响蛋白质的亚细胞定位,许多研究发现泛素对细胞内蛋白质的定位具有调节作用。作为一种类泛素蛋白,Neddylation与泛素化之间的交互作用很常见。但是目前对于Neddylation的研究非常有限,Nedd8究竟怎样影响蛋白质在细胞内的定位也值得更深入的研究。为了解答这个问题,我们尝试运用靶向Nedd8的亚细胞组学技术探讨了 Neddylation修饰对于蛋白质在细胞核与细胞质中定位的影响。实验目的:探究Neddylation修饰对蛋白质在细胞核与细胞质中定位的影响实验方法:构建靶向Nedd8的亚细胞蛋白定量体系:对NEDP1敲除的293T细胞与野生型细胞转染Flag-Nedd8质粒,再对转染后的这两种细胞进行亚细胞裂解,结合 IP-MS(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry)对两种细胞系的细胞核与细胞质中与Nedd8有关的蛋白进行定量分析,得到潜在的Nedd8底物与转位蛋白。运用亚细胞裂解技术得到细胞核与细胞质蛋白;运用Excel对质谱数据进行处理,得到Nedd8的潜在底物与转运蛋白;运用WB(Western Blot)检测蛋白的Neddylation修饰;运用免疫荧光技术检测TAK1(Transforming Growth Factor-Beta-Activated Kinase 1)蛋白在细胞内的定位。实验结果:1.NEDP1敲除后细胞整体以及细胞核、细胞质水平的Neddylation修饰均明显上调。2.亚细胞裂解得到的蛋白具有较特异的细胞质与细胞核分布特性,定量质谱数据对蛋白定位的预测结果与数据库对蛋白质的亚细胞定位注释分布趋势一致。3.通过定量质谱数据处理与筛选,本实验体系中发现81个潜在转位蛋白。4.TAK1可以发生Neddylation修饰,且TAK1发生Neddylation修饰后促进其在细胞核中表达量上调。实验结论:1.亚细胞水平的定量蛋白质组学可以有效分析蛋白质亚细胞定位及蛋白亚细胞定位的改变。2.Neddylation水平升高促进蛋白质发生细胞核-细胞质之间的转位。3.TAK1是Nedd8的底物,TAK1的Neddylation修饰促进其从细胞质转运入细胞核。